Обзор методов работы с днк
«Прогулка по хромосоме» - это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждавшиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК - дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в наших знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах.
Не удивительно, что новые эффективные методы исследований нашли применение не только в фундаментальных исследованиях. Они оказывают глубокое влияние на медицину, ветеринарию, селекцию животных, растений, на микробиологическую промышленность. Приведем всего лишь несколько примеров.
Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит заменаATна ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего β-цепь гемоглобина человека; замена происходит в сайте (CTNAG), чувствительном к рестриктазе Dde I (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действиемDde I y здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена β-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредныемутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике.
Новые методы работы с ДНК позволяют также значительно усовершенствовать методы создания вакцин против различных вирусных заболеваний человека и животных. Такие новые способы, включая клонирование и определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса, применяли при разработке вакцин против ящура-одной из наиболее распространенных в мире тяжелых болезней свиней и крупного рогатого скота. Современные вакцины, приготовленные традиционным способом, используют «инактивированные» или ослабленные препараты, которые, однако, иногда содержат патогенные вирусы, что может приводить к вспышкам болезни. Кроме того, некоторые штаммы вирусов при культивировании в лабораторных условиях не достигают кон-
9. Методы работы с ДНК289
|
Рис. 9.19. Исследование мутации серповидноклеточной анемии на уровне ДНК. А. Нормальная и мутантная последовательности аминокислот и соответствующие им последовательности нуклеотидов в ДНК. Б. Карта сайтов рестрикции клонируемого зонда для участка гена βцепи гемоглобина человека. Широкой полосой изображен транскрибируемый участок ДНК, тонкой линией - нетранскрибируемый участок на 5'-конце гена. В нижней части рисунка показана локализация Dde I-сайтов на рестрикционной карте нормальной и мутантной форм. В. Размеры Dde I-рестриктов ДНК из нормальных клеток (ββ) и клеток, гомозиготных по мутации серповиднрклеточной анемии (βS βS ), определяли с помощью радиоактивного зонда. [Geever R. F. et al. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 5081.] |
|
центраций, достаточно высоких для вакцинации. Разработка синтетических вакцин позволяет решить многие из этих проблем. Основным антигеном вируса ящура является белок головки вируса VP1. Однако сам по себе этот белок, выделенный в очищенном состоянии из вирусных частиц, или полученный из клеток Е. coli, используемых при клонировании гена VP1, обладает слабым антигенным действием и не может использоваться в качестве вакцины. Определение нуклеотидной последовательности клонируемого гена позволяет, зная генетический код (см. главу 12), легко определить полную последовательность аминокислот в белке VP1. После того как полная последовательность аминокислот известна, нетрудно химически синтезировать более короткие полипептиды, обладающие сильными антигенными свойствами и индуцирующими синтез антител против целых вирусных частиц.
290Организация и передача генетического материала
Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, E. coli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2μплазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2μ и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрожжевых клетках, так и в E. coli. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может служить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (интерферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще). Дрожжевые клетки наиболее подходят, по-видимому, для производства не содержащих вирусы вакцин против болезни человека, вызываемой вирусом гепатита В. Этот вирус состоит из нуклеопротеинового кора, содержащего геном вируса и окруженного фосфолипидной мембраной, поверхность которой составляют кодируемые геномом вируса белки. Антигенно активной составляющей является белок поверхности вируса, однако для сильной антигенной активности необходимо, чтобы этот белок входил в состав фосфолипидной мембраны. Мембранная система дрожжевых клеток аналогична системе других эукариотических организмов и отлична от мембранной системы E. coli. Когда белок, кодируемый клонируемым геном вируса гепатита В, накапливается в дрожжевых клетках, то образуются фосфолипидные частицы с белковой поверхностью, которые способны индуцировать производство вакцинируемым организмом антител против вируса в целом. С другой стороны, при накоплении этого белка в клетках E. coli он не связывается с фосфолипидами и поэтому не вызывает сильной антигенной реакции. Применение методов рекомбинантных ДНК к фундаментальным генетическим исследованиям мы рассмотрим в различных главах второй части.