Рекомбинационный анализ мутантовфагаХ174

Когда фаги с различными мутантными генотипами заражают клетку, в которой они могут размножаться, то в потомстве обнаруживаются фаги как с родительскими, так и с рекомбинантными генотипами. Скрещивание между двумя различными ts-мутантами фага выполняют при пермиссивной температуре (30°С), а скрещивание между sus-мутантами фага -в клетках Su ⁺ -штамма. Суммарное число потомков всех генотипов определяют, высевая на чашки определенный объем культуры в пермиссивных условиях. Количество рекомбинантов дикого типа легко определить посевом такой же пробы в непермиссивных условиях, когда негативные колонии образуют лишь фаговые частицы дикого типа (см. рис. 6.2), точно так же, как это было с rII-мутантами фага Т4.

Скрещивание фагов не вполне аналогично скрещиванию эукариотических организмов. Мы знаем, что при скрещивании двух эукариотических родителей 1) генетический вклад каждого родителя в потомство одинаков (это обеспечивается мейозом) и 2) если генетические маркеры не сцеплены, то в потомстве возникает равное число родительских и рекомбинантных генотипов. При скрещивании фагов, однако, относительный генетический вклад родителей в потомство, как было установлено, зависит от относительного числа родительских фагов каждого типа в данной инфицированной бактериальной клетке. Например, если отношение численностей родительских фагов с генотипами А и В равно А/В = 10/1, то часто обнаруживается, что число рекомбинантных потомков превосходит число потомков родительского типа В. При скрещивании фагов число родительских генотипов может быть больше двух. Если одна и та же клетка заражена фагами с тремя различными генотипами А, В и С, то в потомстве некоторые фаги будут обладать рекомбинантным генотипом ABC. Ясно, что динамика скрещивания фагов более сродни проблемам популяционной биологии, чем проблемам индивидуального скрещивания организмов, обладающих мейозом. Совокупность родительских геномов фагов, инфицирующих клетку, пред-

198Организация и передача генетического материала

Таблица 7.3. Частоты рекомбинаций, наблюдаемые при двухфакторных скрещиваниях мутантов фага фХ174

Мутант

А

В

С

D

Ε

F

G

H

ат18 (А)

атЗЗ (А)

ат35 (А)

ат50 (А)

ат86 (А)

ат14 (В)

ат16 (В)

och6 (С)

am10 (D)

атЗ (Ε)

ат6 (Ε)

ат88 (F)

ор6 (F)

am9 G

am23 (H)

amN1 (H)

21.9

±3.2

(2)^+

0.4

21.2

±0.1

±2.4^+

7.9

4.5

13.9

±0.5^+

±0.6^+

±1.0^+

11.7

5.5

16.8

0.5

±2.4^+

±2.0

±1.5^+

±0.1

(2)^+

(2)

2.8

11.3

2.8

2.6

4.0

±0.3

±0.4^+

±0.3

±0.5

±0.2

(2)

2.0

9.1

2.7

6.4

7.3

1.3

±0.1

±2.8^+

±0.1

±0.3

±1.2

±0.3

1.3

3.9

0.7

2.2

1.1

1.0

1.3

±0.2

±0.4

±0.1

±1.3

±0.1

±0.2

±0.3

1.4

6.2

2.0

4.0

4.2

1.8

2.3

2.0

±0.5

±1.0

±0.5

±0.6

±0.2

±0.2

±0.4

±0.2

(2)

(2)

7. Геном вируса 199

Ε

am3(E)

4.1 ±0.6 (2)

10.8 ±0.8 (3)

4.2 ±1.0 (3)

10.2 ±1.6 (3)

8.3 ±0.9 (2)

3.4 ±0.5 (4)

4.6 ±0.9 (5)

1.3 ±0.1 (2)

1.5 ±0.2 (3)

ат6(Е)

6.6 ±1.0

5.7 ±0.8

6.3 ±1.2

8.3 ±2.0

6.5 ±2.0 (2)

2.4 ±0.7

3.5 ±0.4

0.2 ±0.7

0.2 ±0.4

0.2 ±0.4 (6)

F

am88(F)

10.8 ±1.2

12.4 ±2.1

11.9 ±0.3

8.0 ±1.0

5.3 ±0.9

10.3 ±0.7

9.3 ±3.2

11.1 ±2.2

14.4 ±0.6

4.4 ±0.8 (2)

7.1 ±0.7 (2)

op6(F)

6.5 ±0.2

6.0 ±0.2

4.2 ±1.5

1.3 ±0.6

4.8 ±0.4

5.3 ±0.7

2.2 ±0.1

1.2 ±0.1

2.5 ±0.4

G

am9(G)

5.8 ±1.4 (2)

11.5 ±0.8

8.0 ±1.0 (2)

8.2 ±0.8

6.8 ±0.4

2.9 ±0.9

5.4 ±1.2

1.2 ±0.1

5.9 ±2.1

6.8 ±0.8 (9)

4.7 ±1.0

1.3 ±0.2

H

am23(H)

1.7 ±0.8 (2)

2.0 ±0.4

4.7 ±0.5

1.2 ±0.1

0.4 ±0.1

1.8 ±0. (3)

2.1 ±0.4 (2)

2.6 ±0.3

2.2 ±0.6 (2)

3.4 ±0.9

3.4 ±0.4

9.2 ±1.4

2.1 ±0.3

amN1(H)

3.0 ±0.3

7.5 ±1.2

3.1 ±0.2

2.0 ±0.3 (2)

2.1 ±0.3 (2)

3.0 ±0.5

2.8 ±0.5

1.4 ±0.2

4.6 ±0.3 (2)

8.1 ±1.3 (3)

6.2 ±0.9 (2)

4.1 ±0.6

8.1 ±0.5

3.1 ±0.8 (2)

0.26 ±0.3 (2)

* Приводимые значения х 10 ⁴.

⁺ Только эти частоты рекомбинаций цистрона А использовались при построении рисунка 14.19. Числа в скобках означают количество

повторностей независимого определения частоты рекомбинации; приводится среднее значение.

По Benbow R.M. et. al. (1971). J. Virol, 7, 549.

200 Организация и передача генетического материала

ставляет собой популяцию-основателя. Эти геномы реплицируются и рекомбинируют с другими геномами, обладающими теми же или отличными генотипами. Рекомбинантные генотипы реплицируются наряду с родительскими, и при лизисе зараженной клетки освободившиесяфаговые частицы представляют собой выборку геномов из общего генофонда, содержащегося в клетке в момент упаковки ДНК в головки фагов. Кроме того, не все реплицирующиеся геномы родительского типа с равной вероятностью рекомбинируют с геномами других родительских типов. Например, такая ситуация имеет место, если фаг с генотипом А исходно адсорбировался на одном конце длинной бактерии, а фаг с генотипом В - на другом. Исключение некоторых геномов из фонда скрещивания приводит к низкой отрицательной интерференции (с несколько больше 1), наблюдаемой в большинстве скрещиваний между фагами. Причина этого явления состоит в том, что геномы, входящие в фонд скрещивания, т.е. уже участвовавшие в одном акте рекомбинации, имеют больший шанс принять участие и во втором рекомбинационном событии по сравнению с произвольным геномом, который может вовсе не входить в фонд скрещивания.

Хотя механизмы скрещивания у фагов и у эукариотических организмов различны, тем не менее понятия, используемые в генетике эукариот,могут быть применены и к скрещиванию между фагами. Для этого необходимо контролировать проникновение фаговых частиц каждого из двух родительских генотипов в инфицированные клетки и время, отводимое на репликацию и рекомбинацию. Когда эти два фактора контролируются, то есть скрещивание осуществляется в определенных стандартных условиях, то можно определить сцепление между генетическими маркерами и оценить частоту рекомбинации, что позволяет строить генетические карты.

Отношения между перечисленными в табл. 7.2 мутациями фага фХ174 анализировали посредством двухфакторных и трехфакторных скрещиваний. Двухфакторные скрещивания между супрессорчувствительными мутантами осуществляли следующим образом: культуру бактерий Su⁺ заражали двумя мутантными штаммами фага с высокой множественностью (по 5 фаговых частиц каждого типа на бактериальную клетку). Использование такой множественности дает нам уверенность в том, что все клетки инфицируются обоими фагами. После лизиса бактерий по числу негативных колоний на индикаторной культуре,обладающей соответствующими Su⁺ -генами, определяли общее число фагов в потомстве. При скрещивании фаговых мутантов sus_amber в качестве хозяина использовали штамм Su⁺_amber; при скрещивании между sus_amber- и sus_ораl-мутантами или между sus_amber и sus_ochre индикатором служил бактериальный штамм с обоими генами Su ⁺. Число рекомбинантов дикого типа, возникающих при скрещивании, определяли по числу негативных колоний на индикаторной культуре Su ^–, на которой могли размножаться только фаги дикого типа. Частоты рекомбинации, обнаруженные при скрещивании между этими мутантами фага фХ174,представлены в табл. 7.3.

Для того чтобы определить, в каком порядке расположены описанные мутации на генетической карте, использовали трехфакторныескрещивания. При этом применялся метод, несколько отличный от описанного для трехфакторных скрещиваний в гл. 5, поскольку в этом случае было необходимо отбирать рекомбинантов дикого типа по двум

7. Геном вируса201

Рис. 7.4. Пример использования слабосцепленного неселектируемого маркера при определении последовательности маркеров путем трехфакторного фагового скрещивания. I и II - две возможные последовательности расположения трех маркеров. Отбирают рекомбинантов дикого типа между атА и атВ, а затем по генотипу в отношении неселективного маркера определяют правильную последовательность. Например, если гены расположены в последовательности I, то большинство отобранных рекомбинантов дикого типа будет обладать генотипом + + tsC. Для появления рекомбинантов с генотипом 4- + + необходим двойной кроссинговер, и потому такие рекомбинанты встречаются реже. Если же гены расположены в последовательности II, то частоты двух рекомбинантных генотипов будут обратными. Для того чтобы подтвердить правильность установленной последовательности генов, производят реципрокное скрещивание.

маркерам. В описанной ранее ситуации никакого отбора в потомстве не производилось и могли наблюдаться все восемь возможных комбинаций генотипов. Рассмотрим изображенное на рис. 7.4 скрещиваниеamAtsC x атВ. Если атА и атВ сцеплены друг с другом теснее, чем каждый из них с tsC, что устанавливается в двухфакторных скрещиваниях, то tsC используют в качестве неселектируемого маркера при анализе потомства от скрещивания на Su-индикаторе при пермиссивной температуре. Потомки дикого типа в отношении аллелей amber будут формировать негативные колонии независимо от того, содержит их генотип tsC или соответствующий аллель дикого типа. Доля фагов, несущих аллели tsC и tsC ⁺ среди рекомбинантов, позволяет различить последовательности генов amAamBtsC и tsCamAamB. Если в потомстве представлен преимущественно дикий тип, значит, гены расположены в последовательности tsCamAamB. Если же большинство составляют температурочувствительные фаги, значит, порядок расположения генов на карте amAamBtsC. Последовательность, установленная таким скре-

202 Организация и передача генетического материала

Таблица 7.4. Частоты рекомбинации, наблюдаемые при трехфакторных скрещиваниях мутантов фХ174*

Скрещивание	Частота рекомбинации (селективные маркеры)	wt (%) (неселективные маркеры)	Преобладающий генотип (неселективные маркеры)	Порядок генов
	1.2 ± 0.4 0.8 ± 0.3 1.0 ±0.7 1.8 ± 0.4 13.4 ± 3.7 1.4 ± 0.3 0.7 ± 0.1 0.9 ± 0.2 3.0 ± 0.3 4.3 ± 0.5 1.2 ± 0.1 0.3 ± 0.2 0.3 ± 0.2 2.3 ± 0.4 1.5 ± 0.3 4.5 ± 0.6 7.1 ± 2.2 9.7 ± 1.5 1.0 ± 0.4 8.3 ± 1.1 3.0 ± 0.3 6.0 ± 0.8 1.6 ± 0.3	33 90 97 96 91 38 25 88 99 46 43 95 37 16 39 89 77 95 79 34 7 43 99

7. Геном вируса 203

	10.8 ± 2.3 1.4 ± 0.3 1.0 ± 0.4 Low burst^+ Low burst Low burst Low burst 3.9 ± 0.4 3.0 ± 1.2	93 95 45 4 6 95 98 21 97
	14.0 ± 0.5 1.4 ± 0.7 1.3 ± 0.2 1.6 ± 0.1	99 90 99 42
	18.4 ± 1.2 21.9 ± 6.8	55 56

* Приводимые значения х 10 ⁴.

⁺ Это означает, что при скрещивании было получено всего несколько потомков.

По BenbowR.M. et. al. 1971. J. Virol., 7, 549.

204 Организация и передача генетического материала

щиванием, проверяется затем в реципрокном скрещивании (рис. 7.4). Результаты этих трехфакторных скрещиваний представлены в табл. 7.4.

Приводимые в табл. 7.3 и 7.4 данные однозначно свидетельствуют о том, что генетическая карта фага фХ174 имеет форму кольца. Заметим, например, что ген Я тесно сцеплен как с геномG, так и с геномА. Аналогичным образом каждый ген тесно сцеплен с двумя соседними, расположенными по обе стороны от него, и поэтому единственно возможная форма карты-кольцевая. Карта, изображенная на рис. 7.5, отражает тот факт, что геном фага фХ174 представляет собой кольцевую молекулу ДНК. На карте видно, что некомплементирующие мутации локализованы в смежных участках генома. Это означает, что функциональные единицы, выявляемые с помощью комплементационного теста, совпадают соструктурными единицами генома. Границы междугенами на карте указаны произвольно, поскольку использовавшиеся при построении карты мутации не позволяют точно локализовать эти границы. Исследования различных нарушений процесса размножения у конкретных мутантов в непермиссивных условиях позволяют приписать каждому цистрону определенную функцию, как это указано на рис. 7.5.

Геном фага фХ174 представляет собой одноцепочечную кольцевую молекулу ДНК, содержащую 5386 нуклеотидов. Эта нуклеотидная последовательность была успешно расшифрована в 1977 г. Фредериком Сэнгером и его коллегами. Соотношение между генетической картой, изображенной на рис. 7.5, и химической картой будет обсуждаться в гл. 12.