Профагλ

Мутантные гены, содержащиеся в профаге λ и встроенные в бактериальный геном, можно картировать, используя описанные в следующих главах методы генетики бактерий. Такие исследования показали, что профаг λ встраивается в геном Е. coli между генами gal и bio, контролирующими потребление сахара галактозы и синтез витамина биотина соответственно. Последовательность генов на генетической карте профага сравнивали с соответствующей последовательностью на генетической карте фага (рис. 7.8). Они, как ни странно, не тождественны: любая из них получается из другой посредством циклической перестановки. Это различие в последовательности генов возникает из-за механизма, с помощью которого λ-ДНК встраивается в бактериальную хромосому.

Линейная молекула ДНК фага λ имеет комплементарные одноцепочечные концы, состоящие из 12 нуклеотидов. После проникновения в клетку бактерии-хозяина эти «липкие» концы сшиваются ДНК-лигазой и образуется кольцевая молекула. Кольцевая молекула ДНК фага λ может затем встроиться в бактериальную хромосому при участии фагового гена int, кодирующего белок, который катализирует сайт-специфическую рекомбинацию между участком прикрепления ДНК фага к хромосоме бактерии (attP) и соответствующим бактериальным сайтом (attB или attλ). При этом хромосома λ разрывается в attP-сайте, который локализован в середине генетической карты фага, и в результате происходит изменение последовательности генов в профаге, как это показано на рис. 7.8.

После внедрения в бактериальную хромосому все гены λ, кроме двух, перестают работать (инактивируются) и оказываются под контро-

7. Геном вируса209

Рис. 7.8. Карты вирулентного фага и профага λ: показаны механизм интеграции кольцевого генома λ в хромосому хозяина. Сайт attP обозначен символом POP', a сайт attB- символом ВОВ'.

лем репрессора - белка, кодируемого геном cI. Наличие репрессора создает у Е. coli (λ) иммунитет к инфицированию другими фагами λ. Προфаг λ реплицируется как часть родительской хромосомы и наследуется дочерними клетками. В популяции лизогенных бактерий примерно 1 из 10⁶ клеток в каждом поколении вследствие спонтанной индукции профага лизируется и освобождает многочисленное потомство фагов λ (рис. 7.6). Такая способность бактериальной культуры с профагом спонтанно продуцировать фаг объясняет происхождение термина лизогения. Причины спонтанной индукции не ясны, однако известно, что нарушение способности клетки-хозяина реплицировать собственную ДНК может вызвать индукцию. Так, например, ультрафиолетовое облучение индуцирует большинство содержащих профаг клеток культуры. Описаны температурочувствительные мутации сI-гена, вызывающие индукцию при повышенной температуре. Эти мутации дают удобный экспериментальный метод изучения последовательных этапов индукции. Первое событие, связанное с индукцией, - выход профага из хромосомы. Механизм этого процесса аналогичен механизму включения профага.Выход из хромосомы контролируется двумя генами фага λ, int и xis; результатом является образование кольцевого генома λ, который начинает реплицироваться посредством θ-механизма и продуцирует множество дочерних геномов. Впоследствии механизм репликации ДНК меняется на σ-тип. Образующиеся при этом линейные геномы фага инкапсулируются в белковую головку (см. гл. 4).

Профаг λ почти всегда вырезается из хромосомы бактерии точно по своим границам, образуя кольцевую форму интактного генома λ. Иногда, однако, вырезание происходит неточно, что приводит к образованию кольцевой молекулы ДНК, в которой один из концевых участковгенома профага утрачен, а вместо него включен участок хромосомы Е. coli, смежный с другим концом генома профага (рис. 7.9). Такие гибридные молекулы могут продуцировать новые жизнеспособные фа-

210Организация и передача генетического материала

Рис. 7.9. Образование трансдуцирующих фагов λgal и λbio в результате неточного вырезания профага из хромосомы бактериальной клетки.

говые частицы лишь в том случае, если не утрачены какие-либо существенные гены генома λ. Те молекулы, в которые попадает ген bio E, coli (λ bio), жизнеспособны, так как в них обычно отсутствуют лишь несущественные гены между attP и геном N. Напротив, молекулы, в которые попадает ген gal E. coli обычно неполноценны в результате утраты существенных генов, локализованных между attP и левым концом хромосомы. Если какие-либо существенные гены утрачены и фаг неспособен формировать негативные колонии, его называют дефектным и в название такого фага вносится буква d: λdgal. Фаги λdgal или λdbio (в случае, если утрачен существенный ген N) способны размножаться в присутствии нормального фагаλ, компенсирующего функции, нарушенные у этих фагов. Фаги λdgal и λbio легко выявить благодаря их способности трансдуцировать гены gal⁺ и bio⁺ в gаl^– или bio^–бактерии. Эти трансдуцирующие фаги также могут лизогенизировать клетки E. coli (λdgal).

Размер замещенного участка в геноме λ конкретных фаговых штаммов λdgal или λbio можно оценить с помощью комплементационного и рекомбинационного тестов. Например, фагλdgal можно испытывать наспособность либо образовывать рекомбинанты дикого типа в скрещиваниях со множеством различных мутантных линий фага, либо комплементировать с известными мутантами при смешанном инфицировании. В табл. 7.5 представлены данные о наличии или отсутствии рекомбинантов дикого типа при скрещивании нескольких фаговλdgal с носителями определенныхsus-мутаций в различных цистронах. Если в данномштамме λdgal отсутствует соответствующий ген дикого типа, то рекомбинанты дикого типа не образуются. Эти данные позволяют определить положение левого конца, встроенного в геномλ участка генаgal относительно мутаций sus на генетической карте, как это изображено на

7. Геном вируса211

Таблица 7.5. Рекомбинация между λdgαl и sus-мутациями в цистронах левого плеча фага λ
	λ dgal1	λdρα12	λ dgal3	λ dgal4	λdgal5
λ sus A	—	+	+	+	+
λsusB	—	—	+	+	+
λsusE	—	—	—-	+	+
λsusG	—	—	—	—	+
λ susΗ	—	—	—	—	+
λ susΜ	—	—	—	—	—
« + » наличие рекомбинантов дикого типа; « — » их отсутствие. По Campbell A. 1959. Virology, 9, 293.

рис. 7.10. Правый конец этого участка всегда совпадает с сайтом интеграции attP.

После того как получен набор λdgαl фагов с картированными левыми концами, уже легко оказывается определить положение неизвестных точечных мутаций относительно этих концов: требуется лишь узнать, образуются ли рекомбинанты дикого типа между неизвестным мутантом и фагом соответствующей линии λdgαl. Эта методика аналогична методике картирования rII-мутаций с помощью делеций (см. гл. 6).