- •Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 1. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1987. – 295 с.
- •Электронное оглавление
- •9. Методы работы с днк 260
- •Предисловие редактора перевода
- •Предисловие
- •Структура книги
- •Особенности книги
- •Организация и передача генетического материала
- •I. Введение
- •Прокариоты: бактерии и сине-зеленые водоросли
- •Одноклеточные и многоклеточныеэукариоты
- •МейозIi
- •Значение мейоза
- •Литература
- •2.Менделевскаягенетика Первые представленияо наследственности
- •Открытие законов наследственности
- •Методы Менделя
- •Доминантность и рецессивность
- •Расщепление
- •Гены - носители наследственности
- •Независимое комбинирование
- •Тригибридные скрещивания
- •27 Гладкие желтые пурпурные
- •Множественные аллели
- •Генотип и фенотип
- •Литература
- •3. Хромосомныеосновы наследственности Гены и хромосомы
- •Наследование, сцепленное с полом
- •Нерасхождение х-хромосом
- •Вторичное нерасхождение
- •Сцепленное с полом наследование у человека и других видов
- •Определение пола
- •Отношение полов
- •Литература
- •4. Природа генетическогоматериала
- •Бактерии как экспериментальныйобъект
- •Экспериментальные исследованиябактериофагов
- •Нуклеиновые кислоты - наследственный материал вирусов
- •Химический состав и строениенуклеиновых кислот
- •Модель структуры днк Уотсона-Крика
- •Проверка модели Уотсона-Крика
- •Различные формы организациидвухцепочечной днк
- •Организация днк в хромосомах
- •Общие особенности репликации днк
- •Литература
- •5. Геномэукариот
- •Рекомбинация сцепленных генов
- •Генетические карты
- •Трехфакторные скрещивания
- •Генетическая интерференция
- •Когда происходит кроссинговер?
- •Мейоз у грибов
- •Цитологические наблюдениякроссинговера
- •Корреляция между генетическими и цитологическими картами хромосомдрозофилы
- •Внеядерная наследственность
- •Литература
- •6. Тонкая структура гена
- •Бактериофаг как генетическая система
- •СистемаrIi бактериофага т4
- •Природа мутаций в областиrIi
- •Функциональные особенностиrIi-мутаций
- •Цистрон
- •КартированиеrIi-мутаций с помощью делеций
- •Предельная разрешающая способностьрекомбинационного анализа
- •Уточнение генетической терминологии
- •Комплементационный анализу высших эукариот
- •Рекомбинационный анализтонкой структуры генау высших эукариот: дрозофила
- •Литература
- •7. Геномвируса
- •Размножение бактериофагов
- •Мутантные бактериофаги
- •Комплементационный анализусловно летальных мутаций фагаХ174
- •Рекомбинационный анализ мутантовфагаХ174
- •Умеренный бактериофагλ
- •Гены фагаλ
- •Профагλ
- •Сопоставление генетическойи физической карт фага а
- •Организация геномафагов т2 и т4
- •Литература
- •8. Бактериальныйгеном
- •МутантыЕ. Coli
- •Генетические элементыE.Coli
- •Физическое картирование бактериальных генов методомпрерванной конъюгации
- •Кольцевая форма геномаЕ. Coli
- •Подвижные генетические элементы (транспозоны)
- •Генетическое картированиеЕ. Coli
- •Конъюгационное картирование
- •Трансдукционное картирование
- •Обзор результатов генетического анализа
- •Литература
- •9.Методы работы с днк
- •Кинетика ренатурации днк
- •Рестрикция днк и ферменты модификации
- •Рестрикционный анализ молекул днк
- •Определение последовательности нуклеотидов в днк ( секвенирование )
- •Метод рекомбинантных днк
- •Векторы для клонирования днк
- •Библиотеки геномов
- •Обзор методов работы с днк
- •Литература
- •Оглавление
Метод рекомбинантных днк
Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фрагменты ДНК и комбинировать из них in vitro рекомбинантные (или химерные) молекулы. Это оказывается возможно, поскольку многие рестриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цеписдвинуто относительно второй, в результате чего образовавшиеся фрагменты обладают комплементарными одноцепочечными концами (см. табл. 9.1). Эти концы могут соединяться посредством образования водородных связей между комплементарными основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты ДНК, как это показано на
276Организация и передача генетического материала
Рис. 9.10. Образование рекомбинантных молекул ДНК. При действии одной рестриктазы на различные молекулы ДНК образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Соединение таких фрагментов в разных сочетаниях может приводить к образованию рекомбинантных молекул ДНК. Под действием ДНК-лигазы формирование рекомбинантных молекул завершается установлением ковалентных связей. |
|
рис. 9.10. После образования водородных связей между комплементарными основаниями концы фрагментов соединяются ковалентными связями под действием лигазы.
Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструировании химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например, плазмиду или эписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации. Репликация такого репликона будет приводить к размножению также второго фрагмента, составляющего рекомбинантную молекулу. Исходный репликон становится при этом вектором для другого фрагмента ДНК.
В качестве таких векторов для клонирования (или клонирующих векторов) любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг λ и множество различных плазмид. Вектор с клонируемым фрагментом ДНК может проникнуть в клетку Е. coli после того, как клетка обработана ионами Са ++. Такая процедура позволяет конструировать штаммы бактерий, несущих определенные фрагменты чужеродной ДНК (клоны), и размно-
9. Методы работы с ДНК277
жать ДНК этих клонов в больших количествах. Совокупность методов, объединяемых названиями «клонирование», или «генная инженерия», произвели революцию в генетике, биохимии и биотехнологии. В настоящее время ДНК эукариотических организмов может изучаться на уровне последовательности нуклеотидов с той же детальностью, которая еще недавно была возможна лишь в отношении ДНК вирусов. Методы генной инженерии позволяют использовать Е. coli в качестве фабрик для производства продуктов функционирования генов человека, например, для производства инсулина и гормона роста. Вероятно, в недалеком будущем это даст возможность успешно и недорого лечить диабет, возникающий при недостатке инсулина в организме, и карликовость, являющуюся следствием недостатка гормона роста. Методы рекомбинантных ДНК открывают широкие перспективы в решении проблем медицины, сельского хозяйства и химической технологии. Эти методы обещают возникновение новой индустрии, называемой биотехнологией, привлекающей в настоящее время внимание средств массовой информации и финансирующих организаций.