Количественное определение пировиноградной кислоты в моче колориметрическим методом по Умбрайту

Пировиноградная кислота является одним из промежуточных продуктов углеводного обмена. За сутки с мочой выделяется 113,7 – 283,9 мкмоль (10 – 25 мг) пировиноградной кислоты (ПВК). Содержание пирувата в крови здорового человека 34-102 мкМ/л (в среднем 89,1±6,29 мкМ/л).

Принцип метода: ПВК, взаимодействуя с 2,4‑динитрофенилгидразином в щелочной среде, образует 2,4‑динитрофенилгидразон ПВК жёлто-оранжевого цвета, интенсивность окрашивания раствора пропорциональна концентрации пирувата.

Порядок выполнения работы: берут две пробирки, в опытную наливают 1 мл мочи, в контрольную – 1 мл дистиллированной воды. В обе пробирки приливают по 1 мл 2,5% спиртового раствора КОН. Перемешивают содержимое пробирок в течение 1 минуты. В каждую пробирку приливают по 0,5 мл 0,1% раствора 2,4-динтрофенилгидразина, перемешивают и оставляют на 15 минут при комнатной температуре для развития окраски. Пробу фотометрируют на ФЭКе против контроля с синим светофильтром. Расчёт проводят по калибровочному графику, найденную величину умножают на показатель суточного диуреза (мл).

Клинико-диагностическое значение. В физиологических условиях уровень в крови повышается при нагрузке глюкозой, после тяжелой физической работы. При авитаминозе и гиповитаминозе В₁ в крови и других тканях, особенно мозге, накапливается большое количество ПВК и увеличивается её выведение с мочой. Содержание этой кислоты в крови и моче возрастает при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы.

Определение пирувата в крови

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота (ТХУ), 10% раствор;

2. 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ), раствор 10 мг/100 мл;

3. Натрия гидроксид, 10% раствор.

Ход определения

Реагент	Опытная проба, мл	Холостая проба, мл
Капиллярная кровь	0,3	-
Дистиллированная вода	0,7	1,0
Перемешивают стеклянной палочкой для полноты гемолиза эритроцитов
ТХУ	1,0	1,0
Перемешивают стеклянной палочкой, выдерживают 3 минуты и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 минут
Центрифугат	1,8	1,8
ДНФГ	0,4	0,4
Перемешивают и выдерживают 20 минут в темном месте
NaOH	1,0	1,0

Перемешивают, выдерживают 5 минут и колориметрируют в кюветах с толщиной оптического слоя 5 мм при длине волны 450 нм против холостой пробы. Аналогично обрабатывают стандартные растворы, вместо центрифугата и в таком же объеме. Расчет ведут по калибровочному графику.

Контрольные вопросы

1. Какой субстрат участвует в энергетическом обеспечении мышечной деятельности?

2. Какую роль играет витамин В₁ в энергетическом обеспечении мышечной деятельности?

3. В состав каких сложных ферментных систем входит ТПФ?

4. С какими пищевыми источниками поступает в организм витамин В₁?

5. Как проводят количественное определение пировиноградной кислоты в моче?

6. Как определяют содержание пирувата в крови?