Занятие №4 Люминесцентная вирусоскопия и методы флуорохромирования препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:

- Люминесцентный микроскоп;

- готовые препараты для люминесцентной микроскопии;

- предметные и покровные стекла;

- бактериальные петли;

- стерильные пастеровские пипетки;

- спиртовки;

- исследуемый вируссодержащий материал;

- набор флуорохромов;

- раствор Хенкса;

- 96º этиловый спирт;

- термостат.

Люминесценция - холодное свечение. Явление люминесценции сводится к излучению веществами света за счет ранее поглощенной энергии. Явление люминесценции известно давно. Изучение люминесценции началось около 300 лет назад. В настоящее время различают рентгенолюминесценцию, электролюминесценцию, фотолюминесценцию и т.д. Явление люминесценции объясняется законом Стокса: «При люминесценции спектр излучения сдвинут по отношению спектра поглощения в сторону более длинной волны». Не всякое облучаемое тело способно светиться. Свечение ранее облученных тел можно объяснить следующими физическими законами.

Под воздействием источника света тело получает дополнительно определенный квант энергии света, при этом электроны начинают вращаться с огромной скоростью, некоторые, отрываясь от своих орбит, переходят на более высокие орбиты, а потом они могут вернуться на свои орбиты. В момент перехода электронов с одной орбиты на другую, освобождается энергия, т.е. сила, удерживающая электрон на своей орбите, атом испускает определенный квант энергии (света), сумма освобожденной энергии превращается в световой поток и тело начинает светиться.

В биологии глубокое изучение метода люминесцентного анализа про­водится с 1945 года, когда американский ученый Кунст предложил ис­пользовать в гистологии метод люминесцирующих антител. В микробио­логии и вирусологии методы люминесцирующих антител стали приме­няться для обнаружения вируса в исследуемом материале и его идентифи­кации с 1955 года (Кузьмин, Поляков, Мейсель, Михайлов и др.).

Метод люминесцирующих антител в люминесцентной микроскопии является наиболее перспективным, т.к. является экспресс методом диагностики различных бактериальных и вирусных болезней людей, животных, расте­ний. Люминесцирующие тела представляют собой иммунные глобулины, меченные флуорохромами. Отечественная промышленность выпускает более 30 различных флуорохромов-люминесцентных красок (люминофо­ров), но не все они пригодны для мечения антител. В России наиболее часто применяются изоционат флуоресцеина или изотиоционат флуоресцеина, дающий зеленую флуоресценцию, изоционат родамина В или изотиоционат родамина В - оранжевая флуоресценция, и некоторые другие красители. Реже приме­няют алфадиметилесульфохлорид, дающий слабое желтое свечение.

В современных люминесцентных микроскопах люминесценция иссле­дуемых препаратов вызывается, как правило, ультрафиолетовыми лучами ближнего спектра, а также фиолетовыми и синими, имеющими наимень­шие длины волн по сравнению с другими лучами.

Рис. 1. Общий вид люминесцентного микроскопа «Люмам Р-2»:

1 – бинокуляр; 2 – объективы; 3 – предметный столик; 4 – кожух осветительной лампы;

5 – основание.

Оптическая схема современного люминесцентного микроскопа сводит­ся к следующему: лучи от источника света (ртутно-кварцевая лампа) проходят через коллектор и ирис диафрагму, затем попадают в систему све­тофильтров, где фильтры СЗС (сине-зеленый свет) отсекают инфракрасные лучи, БС-УФЛ, ФС - все лучи видимого спектра, кроме синих и фиолето­вых. Дальше синие и фиолетовые лучи (частично УФЛ) проходят ряд со­бирающих линз и попадают на светоделительную пластинку, которая на­правляет их через объектив на исследуемый препарат. Эти лучи, отразив­шись от препарата, проходят через объектив до светоделительной пла­стинки, но они не проходят через нее, а возвращаются к источнику света. Свет же люминесцирующего объекта, как имеющий более длинную волну (по закону Стокса), свободно проходит через светоделительную пластинку и попадает в окуляр. В таком случае исследователь видит в поле зрения светящийся объект.

Флуорохромирование - это обработка препарата флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения препарата.

Отечественная промышленность выпускает специальные набо­ры флуорохромов. Наиболее широко применяется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый и др.) и тиозиловая группа (мримулин). Флуорохром чаще всего используют в водных растворах очень низкой концентрации (от 1 : 1000 до 1 : 1 000 000). Метод флуорохромирования может быть использован при изучении некоторых вирусов (оспы, болезни Борна, аденовирусной инфек­ции и др.).

Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует желто-зеленым цве­том, а рибонуклеиновая кислота – рубиново-красным.

Препараты для метода флуорохромирования можно готовить дву­мя способами:

а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизи­стых оболочек) или суспензии инфицированных клеток наносят1-2 капли рабочего раствора (1:10 000) акридинового оранже­вого, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким об­разом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) пре­парат рассматривают в люминесцентном микроскопе;

б) мазки-отпечатки, полученные из патологического матери­ала, или инфицированные культуры клеток (на покровных стек­лах) фиксируют 96°-ным этиловым спиртом в течение 15-30 мин, промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридинового оранжевого (1:10 000), через 5-10 мин на­крывают покровным стеклом и исследуют.

В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах кле­ток, дает изумрудно-зеленое свечение, РНК, находящаяся в ци­топлазме, светится красным или оранжевым цветом. В препара­тах ДНК-содержащих вирусов, например аденовируса, вирусный материал светится зеленым цветом в ядре в виде гранул различ­ной величины. При наличии в препарате РНК-содержащего ви­руса, например, вируса гриппа, вирусный материал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.

Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное), применяют обработку препаратов 0,5%-ным ра­створом РНК-азы или ДНК-азы в течение 5-10 мин или облуче­ние УФ-лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные продолжают светиться еще 20-30 мин. Это служит доказательством специфичности вирусных нуклеи­новых кислот.

Метод простого флуорохромирования несложен, однако и большинстве случаев он не дает возможности полно дифферен­цировать возбудителей болезней.