Методы концентрации вирусов в рабочей суспензии.

При многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации. В таком случае вирус настолько мал, что выделить его не удается, поэтому применяют концентрацию вируса, используют 3 метода:

1. Метод дифференциального центрифугирования

2. Метод фильтрации рабочей суспензии через коллоидные фильтры

3. Адсорбционный метод

   1. Метод дифференциального центрифугирования.

Метод основан на том, что вирусные частицы в жидкости значительно легче суспензируются, чем обрывки тканей или микроорганизмов. Метод заключается в следующем:

10% рабочую суспензию разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют:

1. 2,5 - 3 тыс. об/мин - 10-15 мин. (оседают твердые частицы и тканевые элементы).

2. Берется 2/3 надосадочной жидкости, центрифугируется при 6,0 – 8,0 тыс. об/мин - 15-20 мин. (оседают микроорганизмы).

3. Берется 2/3 надосадочной жидкости, центрифугируется 20–25 тыс. об/мин - 20-25 мин. (оседают вирусы).

Осторожно удаляют 2/3 надосадочной жидкости, встряхивают, вирусы суспензируются и его концентрация в 2-3 раза будет выше, чем в первоначально приготовленной рабочей суспензии, и он будет очищен от тканевых элементов и микроорганизмов.

2. Метод фильтрации рабочей суспензии через коллоидные фильтры.

Поры коллоидных фильтров пропускают только воду, но не пропускают микробы и вирусы. При фильтрации 10% рабочей суспензии вирусы адсорбируются на поверхности фильтра, микробы нет. Фильтр промывают фосфатно-буферным раствором. При этом удаляются крупные тканевые частицы и значительная часть микрофлоры. Фильтр измельчают и помещают в меньший объемом стерильного фосфатного буфера. Центрифугируют 10-15 минут при 8000 об/мин. При этом в осадок уйдут частицы коллоидного фильтра, бактериальная микрофлора. А в надосадочной жидкости останется вирус, и его концентрация будет больше, чем в исходном растворе.

3. Адсорбционный метод (по Соколову).

Метод основан на способности вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов. Спектр адсорбционной способности вируса широк – частицы глины, гипса, угля, гидроокись алюминия и др., что находит применение в вирусологической практике.

Сущность метода: берется 20 мл вируссодержащей жидкости, добавляется 1%-ая взвесь отмытых эритроцитов кур или других животных (1% к объему жидкости). Смесь встряхивают, помещают в холодильник при температуре +4⁰С+5⁰С на 2-3 часа. При этом вирус адсорбируется на эритроцитах. Смесь центрифугируют при 1,5 - 2,5 тыс. об/мин - 5-10 минут, в результате чего в осадок выпадают эритроциты вместе с адсорбированным вирусом. Надосадочную жидкость сливают, добавляют к осадку 2 мл физиологического раствора, осадок встряхивают, помещают в термостат при температуре 37⁰С на 2 часа, где происходит элюция (сползание) вируса с эритроцитов. Суспензию центрифугируют при 1,5 - 2,0 тыс. об/мин - 5-10 минут. В осадок выпадают эритроциты, а в надосадочной жидкости находится вирус концентрация которого в 10 раз больше, чем в исходном вируссодержащем материале.