Методы экспериментального заражения лабораторных жи­вотных.

Вируссодержащий материал может быть введен лаборатор­ным животным различными методами. Наиболее часто используют­ся заражения: подкожное (п/к), внутрикожное (в/к), внутримышеч­ное (в/м), внутрибрюшинное (в/б), внутри­венное (в/в), интраназальное (и/н), интраце-ребральное (и/ц). Однако в каждом конкрет­ном случае исследователь стоит перед вы­бором введения материала каким-то одним способом.

Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Под тропизмом вируса понимают способность его реп­родуцироваться в определенных типах кле­ток организма. Вирусы, репродуцирую­щиеся в нервных клетках, называются нейротропными (например, вирус бешенства), репродуцирующиеся в клетках кожи - дермотропными (например, вирус оспы), в клетках легких - пневмотропными (вирус гриппа). Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются политропными (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток - пантропными (вирус чумы собак).

Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус оспы - внутрикожно, вирус бе­шенства - интрацеребрально. Пантропные вирусы лучше раз­носятся по организму при введении их внутривенно или внутрибрюшинно.

Если же исследователь не имеет данных о тропизме находящего­ся в материале вируса, то заражают животных нескольких групп раз­ными методами.

Объем заражающей дозы материала значительно варьирует в за­висимости от метода внесения и вида животных (0,1-5,0 мл).

Очень часто при первичном заражении не выявляется ви­рус, тогда через эти же биологические системы осуществляют второй и третий пассажи вирусов - «слепые пассажи». При отрицательном результате трех пассажей исследования по выделению активных форм вирусов прекращают. Под пассажем понимают заражение чувствительной живой системы с целью получения от нее новой популяции вируса.

За зараженными животными ведут наблюдения, отмечая изменения в их поведении, появление специфических сим­птомов болезни в соответствии с инкубационным периодом данной инфекции.

Действие вируса проявляется на лабораторных и естест­венно-восприимчивых животных следующим образом: 1) ги­белью через определенный период времени; 2) развитием кли­нических признаков болезни; 3) патоморфологическими из­менениями в органах и тканях павших животных.

Известно, что фильтрующиеся вирусы в отличие от микробов не развиваются на искусственных питательных средах. Поэтому для культивирования их применяют другие методы: используются лабораторные моде­ли культуры клеток, лабораторных животных и куриные эмбрионы.

В последнее время очень часто для культивирования вирусов приме­няют куриные эмбрионы (КЭ). Они имеет ряд преимуществ перед лабораторными животными:

1. Куриные эмбрионы дешевле лабораторных животных (яйцо в два - три раза де­шевле белой мыши).

2. Не требуется затрат на содержание.

3. Легко фиксировать, проще работать.

Курные эмбрионы в большинстве случаев свободны от возбудителей спонтан­ных, скрытых вирусных заболеваний КЭ и в вирусологических лабораториях применяется с целью:

1. Выделения вируса из исследуемого материала.

2. Накопления вируса путем пассажа.

3. Проведения серодиагностики.

4. Получения живых и убитых эмбрион - вакцин.

5. Изучения свойств вирусов.

Куриные эмбрионы с успехом можно применять и для культивирования хламидий, риккетсий, бруцелл и других микроорганизмов.

Свежее племенное яйцо для КЭ желательно отбирать крупное с непигментированной скорлупой (лучше от кур породы Леггорн), от крупного эмбриона можно больше собрать вируссодержащего материала и в нем хорошо видны при овоскопии эмбрион и пуга. Кроме того эмбрионы породы Лег­горн легко заражаются и неприхотливы к условиям инкубации.

Эмбрион должен быть не старше 7-9 суток, иначе будет большой отход при заражении.

Инкубацию производят при температуре +37°С - +38°С и относи­тельной влажности 40-50% и яйца переворачивают 2-3 раза в день.

Зародыш формируется в яйце еще в утробе курицы. В 1-2 дня инкуба­ции закладывается головной и спинной мозг, а также скелетная мускула­тура. На 2-ой день закладывается сердце, кровеносные сосуды, нервы, а в дальнейшем половые железы. На 5-ый день бурно развивается головной мозг, появляются пигменты зрачка. На 8-е сутки эмбрион уже похож на цыпленка. На 9-10 сутки появляется пушок, а на 13-е сутки пух и ясные контуры цыпленка.

Схема строения КЭ в возрасте 7-9 дней

1. Эмбрион.

2. Амнион.

3. Желточный мешок.

4. Аллантоисная полость.

5. Белок.

6. Хорионаллантоисная оболочка.

7. Подскорлуповая оболочка.

8. Пуга.

9. Скорлупа

Под скорлупой находится перепончатая или подскорлуповая оболочка, которая у тупого конца раздваивается - один слой идет под скорлупой, окаймляя пугу (воздушную камеру), а другой над белком. Примерно в центре развивается эмбрион. Последний окружен аминионом, с противоположной стороны от аминиона находится желточная полость (мешок).

С 3-го дня начинает развиваться аллантоисная полость, где скапливаются продукты обмена КЭ, он огибает желток, распространяется к тупому кон­цу, огибает зародыш и срастается с хорионом, располагающемся под скорлуповой оболочкой и образуется хорионаллантоисная оболочка. В остром конце яйца будет остаток белка, а в тупом пуга.

Через хорионаллантоисную оболочку осуществляется газообмен. Жел­ток является главным резервуаром питательных веществ для зародыша. В аллантоис впервые дни выделяются продукты обмена веществ эмбриона, а по мере рассасывания белка аллантоис является поставщиком воды и минеральных веществ. Амнион служит буферной камерой для эмбриона. По мере роста и развития эмбриона объем желтка и белка уменьшается, а аллантоисная и амниотическая полость увеличивается.

Для заражения используют эмбрионы в возрасте 7-12 суток. Раньше 7 дней эмбрионы мелкие и плохо проводить заражение, а старше 12 дней КЭ не рекомендуется использовать, во- первых, потому что жидкость по­лостей мутнеет и при хранении ее соли оседают в виде хлопьев, на кото­рых также может адсорбироваться вирус. Во- вторых, на коже эмбриона появляется пушок, на котором также может адсорбироваться вирус.

Важным условием при работе с КЭ является соблюдение асептики. Необходимо предотвратить попадание в яйцо микробов. Если микробы попадут в яйцо, то они быстрее разовьются, чем вирус, и эмбрион может погибнуть еще до накопления вируса. Поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

1. В лаборатории должны быть бокс с бактерицидными лампами и ионизатор, перед работой с КЭ бокс следует подвергать обработ­ке этими лампами в течение 2-3 часов.

2. Пользоваться только стерильными инструментами.

3. Работа в боксе проводится в халатах, головных уборах.

4. Строго соблюдать правила предварительной обработки скорлупы.

Перед заражением необходимо убедиться в жизнеспособности эмбрио­на. Для этого в затемненной комнате проводят овоскопию. Если эмбрион жив, то он будет смещаться, сокращаться. Можно различить туловище, глаза (темное пятно правильной округлой формы). Сосуды красные, хо­рошо наполненные кровью, иногда видна пульсация крупных сосудов. Если эмбрион погиб, то он не шевелится, мертвый эмбрион темнее, сосу­ды темные, эмбрион "болтается". При овоскопии отмечают простым карандашом контуры пути, а крестиком предлежание эмбриона - глазок. Иногда можно отметить крупные сосуды и некоторые полости.