Самостоятельная работа студентов:

1. Студенты готовят 10% рабочую суспензию из патматериала.

2. Студенты рассчитывают дозу антибиотиков и добавляют их к 10% рабочей суспензии, а затем делают посев на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ).

3. Студенты проводят концентрацию вирусов адсорбционным методом.

Контрольные вопросы:

1. Каким образом готовится 10% рабочая суспензия из патматериала?

2. Каковы методы очистки вируссодержащего материала?

3. Каковы методы концентрации вируссодержащего материала?

Занятие №3 Световая вирусоскопия.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить посевы рабочей суспензии на МПА, МПБ, МППБ после биологического метода очистки. Ознакомиться с принципами световой вирусоскопии и методами окраски препаратов по Муромцеву, Морозову, Романовскому на обнаружение внутриклеточных элементарных телец-включений.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:

- Световой микроскоп для каждого студента

- готовые препараты из патматериала с тельцами Бабеша-Негри, Пашена, Руборта.

- три микроскопа для демонстрации готовых препаратов.

- ванночки для окрашивания мазков на обнаружение телец-включений.

- концентрированная краска Романовского.

- флаконы для разведения краски.

- свежий патологический материал (лучше селезенка).

- предметные стекла, ножницы, скальпель, пипетки 1 мл, 10 мл.

- фиксирующая жидкость (спирт-эфир(1:1) или ацетон)

- кюветы для фиксации препаратов.

Световая вирусоскопия применяется для обнаружения с помощью светового микроскопа, в мазках из патологического материала при ряде вирусных заболеваний животных, внутриклеточных телец-включений и элементарных телец.

Долгое время считалось, что вирусы не видимы в световой микроскоп, однако, позже было установлено, что некоторые наиболее крупные вирусы величиной 200-300 нм, при отдельных способах окраски, находятся на границе видимости в световом микроскопе. Эти множественные внутриклеточные частицы были впервые установлены Боллингером еще в 1873 году. В 1904 году Борелю удалось обнаружить подобные образования в клетках кожи птиц, больных оспой. В 1906 году Пашен обнаружил и описал аналогичные тельца при оспе овец. Вскоре ученые обнаружили подобные образования при оспе человека, крупного рогатого скота, коз, кроликов и других видов животных и птиц. Эти внутриклеточные образования, обнаруженные в инфицированных вирусом клетках кожи, были названы элементарными тельцами. При изучении этих телец в электронном микроскопе было абсолютно доказано, что мелкая и крупная внутриклеточная зернистость представляет собой отдельные зрелые вирионы крупных вирусов или их скопление в клетке. Путем изоляции элементарных телец из пораженной клетки с последующим заражением ими чувствительных животных, во всех случаях воспроизведено типичное заболевание.

Таким образом, элементарные тельца представляют собой отдельные зрелые вирионы (подобно кокку, бактерии, бацилле) или их скоплении в клетке.

Кроме элементарных телец, при некоторых вирусных заболеваниях, в цитоплазме и ядре пораженных клеток были обнаружены сравнительно крупные образования, получившие название телец-включений.

В одной инфицированной клетке их количество может колебаться от 1 до 5-6 образований. По форме эти образования могут быть круглые, овальные. Реже квадратные, треугольные и др. Размеры их колеблются от 1-20 мкм. Поэтому их хорошо видно в обычный световой микроскоп, в препаратах окрашенных специальными методами. В окрашенных препаратах тельца-включения имеют оксифильное родство и воспринимают определенный спектр краски, в то время как клеточные структуры имеют основное тинкториальное родство к краскам. Поэтому тельца-включения избирательно окрашиваются в различный цвет, а клеточные структуры в голубой или фиолетовый цвет. При других способах окраски тельца-включения окрашиваются в соответствующий цвет, более интенсивный, по сравнению с цитоплазмой или ядром, и становятся хорошо видимы в клетках.

Поскольку тельца-включения и элементарные тельца строго специфичны, обнаруживаются только при определенных вирусных заболеваниях и не встречаются в клетках здоровых людей и животных, то обнаружение их с учетом эпизоотической ситуации, клинических симптомов болезни и картины вскрытия, является основанием для постановки окончательного диагноза. При коротком инкубационном периоде болезни телец-включений может и не быть, а поэтому для диагностики этих заболеваний применяют другие методы исследований.

Хорошо изучены элементарные тельца Боллингера при оспе птиц, тельца Пашена при оспе овец, тельца Гварнери- при оспе-вакцине, тельца Бабеша-Негри- при бешенстве, внутриядерные тельца Иост-Догена- при болезни Борна лошадей (инфекционном энцефаломиелите лошадей0, тельца Лентца- при чуме плотоядных, тельца Руборта- при инфекционном гепатите плотоядных и др. при некоторых заболеваниях в пораженных клетках встречаются безымянные тельца-включения. Происхождение большинства телец-включений до настоящего времени изучено недостаточно. Одни ученые считают, что тельца-включения это скопление вирусов. Другие ученые считают, что тельца-включения есть скопление незрелых и погибших вирионов под действием защитных механизмов клетки хозяина. Третья группа считает, что тельца-включения это скопление инактивированных вирусов и нарушенного клеточного метаболизма под действием вируса. Четвертая группа ученых считают, что тельца-включения есть одна из стадий репродукции вируса. Множество научных гипотез относительно происхождения телец-включений связано с тем, что изолированными очищенными тельцами-включениями не всегда удается воспроизвести вирусное заболевание у чувствительных животных.

Наиболее распространенными способами окрашивания препаратов для обнаружения телец-включений является их окраска по методу Романовского, Муромцева, Для обнаружения элементарных телец- окраска по Морозову, Романовскому, Михину.