Техника заражения культур клеток.

Перед заражением путем микроскопии отбирают пробирки культур клеток (КК) с хорошим сплошным монослоем. Дальнейшая работа с культурами клеток проводится в стерильном боксе. Заражение КК проводят 10% рабочей суспензией, приготовленной из исследуемого материала (патматериала) или вируссодержащим материалом, свободным от бактериальной и грибковой микрофлоры.

Применяют 2 способа заражения.

1. С выросшего монослоя в пробирках сливают ростовую питательную среду, клеточный слой ополаскивают раствором Хенкса для удаления белка питательной среды и продуктов клеточного обмена. Затем в КК наливают 0,8мл вируса или рабочей суспензии.

4-6 пробирок с КК оставляют для контроля, где только заменяют питательную среду.

Зараженные и контрольные пробирки с КК помещают в термостат при температуре +37С.

2. Сливают ростовую питательную среду. На клеточный слой наносят исследуемый материал или вирус. Плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают 1-2 часа на контакте. За это время вирус адсорбируется на поверхности клеток и частично проникает внутрь клеток. Затем монослой промывают раствором Хенкса, сливают жидкость вместе с продуктами клеточного обмена и не адсорбированным вирусом. В каждую пробирку наливают по 1мл поддерживающей питательной среды, плотно закрывают пробками, укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6 и ставят в термостат на инкубацию.

Ежедневно проводят микроскопию КК на выявление ЦПД. Микроскопию всегда начинают с контрольных КК.

Наиболее широко применяют стационарное инкубирование в термостате при 37 °С. При этом матрасы кладут в горизонтальном положе­нии, пробирки - под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий заражен­ные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе - рол­лерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.

Наиболее широко и часто о размножении вируса в куль­туре клеток судят по цитопатическому (цитопатогенному) эффекту или цитопати­ческому (цитопатогенному) действию.

Американский ученый Хуанг в 1945 году объединил все дегенеративные изменения в пораженной вирусом клетке под общим названием ЦПД или ЦПЭ (цитоплазменное действие вируса или цитоплазменный эффект).

ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса.

ЦПД - это морфологические и функциональные изменения в культуре клеток под действием вируса, т.е. дегенерация, перерождение разрушение и гибель клетки.

Физиологические изменения клеток установить довольно слож­но, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, исполь­зуя малое увеличение (объектив х8-10, окуляр х7-10), осмот­реть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с та­кими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп от­личия зараженной культуры клеток от контрольной можно счи­тать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь мо­нослой или отмечаться только в виде небольших очажков изме­ненных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена ви­русом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если измене­нию (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в про­бирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если ³/₄ - на три, если 12 - на два креста, 1₄- на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.

Нельзя допускать дегенерации всех клеток монослоя, т.к температура термостата (+37С) инактвирует значительную часть освободившегося вируса в культуральной жидкость. Выраженные поражения 50% клеток монослоя свидетельствуют об активной репродукции вируса во всех клетках. Зараженные пробирки или матрацы энергично встряхивают, клетки разрушаются, вирус заходит в питательную среду, которая называется культуральная жидкость.

Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида кле­ток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 сут. после заражения (энтеровирусы), другие - через 1-2 нед. (аденовирусы).

Ряд авторов пытались сгруппировать сходные формы ЦПД. У од­них получилось 23 формы, у других - 11, У третьих -5 и т.д. Но наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.

Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты, ко­торые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление - потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, при­нимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плава­ют в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, адено­вирусы и др.).

Симпластообразование - растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по пери­ферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием виру­са или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цито­плазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот ме­тод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широ­ко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы сви­ней некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.) Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность кле­точного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.

Таким образом, ЦПД - это погибающие или погибшие клетки под действием вируса. Такие же дегенеративные процессы под действием вируса проходят и в клетках больных животных и людей.

Классификация ЦПД по Эндерсу включает 3 типа дегенерации в клетках.

1-й тип-набухание и округление инфицированных клеток с последующим появлением в них их цитоплазме выраженной зернистости, за счет фрагментации ядра и скопления продуктов нарушенного клеточного обмена. Затем эти клетки разрушаются.

2-й- образование цитоплазматических и внутриядерных включений с последующим разрушением клеток.

3-й- характеризуется образованием гиганских многоядерных клеток симпластов, за счет слияния нескольких разрушенных клеток с цитоплазматическими и внутриядерными включениями.

Один вирус может вызвать дегенерацию клеток по 1 типу, другой по 2 типу и т.д. Эти изменения настолько характерны, что становится возможным не только определить наличие вируса в клетке, но и до некоторой степени судить о принадлежности вируса к тому или другому семейству.

Профессор Анджепаридзе внес существенные дополнения в оценку ЦПД, уточнил и детализировал этапы дегенеративных изменений в пораженных вирусом клетках.

1.Набухание и округление клеток.

2.Появление в цитоплазме мелкой зернистости.

3.Появление в цитоплазме крупной зернистости.

4.Выпадение пораженных клеток из монослоя.

5.Фрагментация ядра.

6.Распад клеток образованием гиганских многоядерных клеток за счет слияния отдельных разрушенных клеток.

7.Отсутствие видимых дегенеративных изменений в клетках(латентная вирусная инфекция).

При неопластической трансформации пораженных клеток в мо­нослое образуются плотные фокусы трансформации различной ве­личины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).

Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к «слепым» пассажам. Необходимо провести не менее трех «слепых» пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.