Методы очистки вируссодержащего материала.

Вируссодержащий материал необходимо освободить от взвешенных плотных частиц песка и стекла, от обрывков тканей и клеточных элементов, от бактериальной и грибковой микрофлоры. Существует несколько методов очистки. Они бывают механические, физические, химические и биологические.

Механические:

1. Фильтрация. Рабочую суспензию освобождают от сравнительно крупных взвешенных твердых частиц через бактериальные фильтры (свечи Пастера, Беркефельда, фильтры ВГНКИ, фильтры Зейтца). При этом вируссодержащий материал освобождается от клеточных элементов и бактериальной микрофлоры.

2. Центрифугирование. 10% рабочую суспензию наливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 6-8 тыс. об/мин- 10-15 минут. При этом осаждаются не только частицы песка, стекла, обрывки клеток, но и бактериальная микрофлора. В надосадочной жидкости останется чистое вещество. Отбирают 2/3 надосадочной жидкости в стерильных условиях.

Физические:

Метод термолизиса. Рабочую суспензию помещают в стерильную пробирку и её погружают в сосуд с сухим льдом (-70⁰ С) и 96⁰С спиртом; через 15-20 минут накрывают и выдерживают до замораживания, а затем пробирку с рабочей суспензией переносят в термостат на 30 минут. Эту манипуляцию повторяют 3-4 раза. При такой обработке происходит разрыв тканей, микробных клеток и освобождение вируса. Затем готовят 10% рабочую суспензию, которую при 4000 об/мин центрифугируют 10-15 минут. В осадок уходят обрывки тканей, микробы и клеточные элементы, а в надосадочной жидкости остается чистый вирус.

Химический метод очистки используется при работе с известными вирусами, на которые эфир или хлороформ не оказывает губительного действия, т.е. является эфиро и хлороформо устойчивым.

В пробирку с 10%-ной рабочей суспензии добавляют равный объем хлороформа или эфира и помещают в холодильник при температуре минус 10-20⁰С на 20 минут. Затем суспензию встряхивают 20 минут и центрифугируют при 3000-4000 об/мин в течение 20-30 минут. Хлороформ, эфир действует губительно на микрофлору, но не действует на вещество, так микрофлора погибает через 10-15 минут.

Биологический метод очистки.

Известно, что многие антибиотики не оказывают губительного действия на вещества, надежно убивают бактериальную микрофлору. С этой целью к рабочей суспензии добавляют пенициллин - для подавления грамм «+» микрофлоры, стрептомицин для подавления грамм ‹- › микрофлоры и нистатин для подавления грибковой микрофлоры в дозе от 500 до 2000 ЕД./мл в зависимости от степени бактериального загрязнения материала, и выдерживать 1 час. Для проверки суспензии на стерильность в отношении бактериальной микрофлоры делают посевы на МПА, МПБ, МППБ среду Сабуро или Чапека. Если в течение 3 суток роста микрофлоры нет, то суспензия считается стерильной и она пригодна к дальнейшей вирусологической работе по культивированию вирусов. Этот метод используется наиболее часто в лабораториях для очистки вируссодержащего материала от бактериальной микрофлоры.