Внедрение в практику.

Получены патенты Российской Федерации: -№ 2031948 «Фрагмент ДНК LTf, предназначенный для выявления гена термолабильного энтеротоксина энтеробактерий» (27.03.1995 г.); -№2049822 «Фрагмент ДНК CFv, используемый для выявления энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I» (10.12.1995 г.); -№2271003 «Способ выявления наиболее значимых возбудителей негонококковых урогеннитальных инфекций (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex T/IT) у детей с использованием метода ПЦР» (27.02.2006 г.).

Разработана медицинская технология: ^«Комплексное ПЦР-обследование пациентов с инфекционно- аллергическими заболеваниями органов дыхания», 2008 г. Разрешение № 209/084 от 21.04.09 Минсоцздрава РФ.

Материалы работы послужили основой для следующих документов: -пособие для врачей «Полимеразная цепная реакция для выявления пилорического хеликобактера», 2000 г. утверждено председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В.И., протокол №5 от 28.11.2000 г;

-методические рекомендации «Метод ПЦР-диагностики в обследовании новорожденных и детей первого года жизни», 2000 г. утверждены Главным государственным санитарным врачом Нижегородской области Петровым Е.Ю.;

-пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций», 2002 г. утверждено председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В.П., протокол №4 от 25.12.2001 г.;

-пособие для врачей «Комплексное ПЦР-обследование на наличие возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций женщин с гинекологической патологией и отягощенным акушерско-гинеколгическим анамнезом», 2005 г., утверждено Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии МЗ РФ академиком РАМН Покровским В.И., протокол №5 от 02.12.2005 г.

И были использованы при составлении: -книги для практического врача «Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя», г. Нижний Новгород, 2004 г.;

-аналитического обзора «Молекулярно-биологические методы в микробиологической диагностике», 1998 г.;

-аналитического обзора «Современные методы диагностики ИППП», 2007 г. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для успешного внедрения и использования метода ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний необходимо проведение стадий адаптации, оптимизации диагностикумов, определение наиболее важных и существенных аспектов, требующих привлечения ПЦР.

2. ПЦР может успешно использоваться для первичной скрининговой детекции бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и санитарно-эпидемиологическом надзоре. Эффективность этиологической диагностики возрастает при одновременном выявлении ведущих инфекционных агентов: бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Y. enterocolitica.

3. Использование отечественных ПЦР тест-систем позволяет проводить не только первичную индикацию Н .pylori, осуществлять оценку количества инфекционного агента и контролировать эффективность антихеликобактерной терапии, но и получить ряд существенных характеристик микроорганизма, таких как наличие генов факторов патогенности cagA и vakA, устойчивости к антибиотикам - макролидам без культивирования микроорганизма.

4. Наиболее значимыми направлениями использования ПЦР в решении проблемы парентеральных вирусных гепатитов является определение результативности противовирусной терапии, интенсивности репликации вирусов при моно- и смешанном инфицировании, совершенствование профилактики вертикального пути передачи вирусов. Для этого успешно может быть использован разработанный нами экономичный полу количественный вариант ПЦР.

5. ПЦР является основным методом детекции возбудителей НУГИ, позволяющим эффективно выявлять любой из микроорганизмов этой группы (вирусы, бактерии). Наиболее эффективно и экономически оправдано одновременное выявление у пациента пяти наиболее значимых и распространенных возбудителей: U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II в пуле субстратов (смеси соскобов слизистых уретры, вагины, цервикального канала у женщин; смеси соскоба слизистой уретры и осадка мочи у мужчин; смеси слюны, мочи, слезного отделяемого у детей), в которых наиболее вероятно их присутствие.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на Ученом Совете ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28.02.2008 г., протокол № 2.

Результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде Биохимического общества РАН, г. Москва 1997 г.; на I Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 1999 г.; на II Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2000 г.; на III Российском форуме «Мать и дитя», г. Москва, 2001 г.; на Научно- практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика , протеомика и биоинформатика для медицины», г. Москва, 2002 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», г. Москва, 2002 г.; на Всероссиской научно- практической конференции «Медицинская микробиология — XXI век», г. Саратов 2004 г.; на Всероссиской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», г. Москва, 2004 г.; на Научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н.Новгород, 2004 г.; на VII Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», г. Н.Новгород, 2006 г.; на Научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Н.Новгород, 2006 г.; на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007», г. Москва, 2007 г.; на Международном симпозиуме «Папилломавирусная инфекция и злокачественные образования. Интегрированная система надзора и профилактики», г. С-Петербург, 2009 г.; на X Международном медицинском форуме «Профилактика заболеваний - основа качества медицинской помощи и благополучия человека», г. Н.Новгород, 2009 г.

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории молекулярно- генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями ФГУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной» Роспотребнадзора. Исследования осуществлялись в рамках Федеральной Программы «Здоровье населения России», отраслевой научно- исследовательской программы МЗ РФ № 034 «Эпидемиология и микробиология» по договору «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и использование их в эпиднадзоре» и ведомственной (отраслевой) целевой программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 г.г» по комплексной теме «Разработка комплексных мероприятий по диагностике, профилактике, лечению и эпиднадзору за актуальными инфекциями».

В настоящее время предложенные нами алгоритмы ПНР диагностики ОКИ, хеликобактериоза, вирусных гепатитов, НУГИ используются практическими лабораториями медицинских учреждений Нижнего Новгорода, применяющими метод ПЦР, что увеличивает точность индикации патогенов и приносит существенный экономический эффект за счет оптимизации расхода диагностикумов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 69 печатных работ, среди них - 10 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 9 - в других журналах; 42 —в материалах конференций, съездов, форумов, 3 - патенты; 5 - методические материалы.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 94 отечественных и 304 зарубежных источника. Работа изложена на 310 страницах, компьютерного текста. Включает 46 таблиц, 38 рисунков и 2 приложения. Личный вклад.

Автором впервые в Нижегородском регионе проведено освоение метода ПЦР и создан многопрофильный диагностический ПЦР центр, позволивший проводить выявление более 30 актуальных инфекционных агентов. Автор осуществлял планирование, организацию, проведение ПЦР исследований и обработку их результатов по всем 4 направлениям работы. На этапах внедрения и адаптации методов он совместно с сотрудниками участвовал в лабораторных исследованиях. Автором систематизированы и обобщены результаты микробиологических и иммунологических исследований, которые проведены сотрудниками лабораторных баз; подготовлены заявки на изобретение, новая медицинская технология, методические рекомендации, пособия для врачей, аналитические обзоры. В работу вошли результаты совместных исследований с Соринсоном С.Н., Бокаревым A.A., Бруснигиной Н.Ф., Черневской О.М., Скобло J1.E.,Маховой М.А., Орловой К.А., Немовым В.В., которые представлены публикациями в соавторстве. Автор выражает огромную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями, сотрудникам ЛПУ, учреждений Роспотребнадзора, практических лабораторий Нижнего Новгорода, принимавших участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов

.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Современные молекулярно-биологнческне методы диагностики инфекционных заболеваний

Методы, основанные на изучении особенностей строения нуклеиновых кислот, достаточно давно применяются для решения практических задач эпидемиологии и медицинской микробиологии. В настоящее время невозможно представить таксономию бактерий без таких критериев, как нуклеотидный состав ДНК и молекулярная гибридизация ДНК-ДНК. Эти показатели являются базисом современной систематики бактерий [8, 9].

Начало бурного развития молекулярной биологии приходится на 50-е годы прошлого века (эпохальные работы Э.Чаргаффа, Дж. Уотсона и Ф. Крика, М. Ниренберга, также А.Н. Белозерского). Результатом активного исследования нуклеиновых кислот явилось формирование практического направления, получившего название «генная инженерия», в рамках которого был разработан комплекс пионерских методических подходов:

• открыты ферменты - эндонуклеазы рестрикции, позволяющие разрезать молекулы ДНК в участках с определенными последовательностями нуклеотидов;

• разработана технология создания и введения в клетки прокариот и эукариот гибридных молекул ДНК, состоящих из фрагментов разных геномов;

• подобраны ферментативные системы для синтеза ДНК и РНК in vitro;

• предложены методы высокоэффективного введения в молекулы ДНК и РНК радиоактивных, флюоресцентных и других типов меток;

• созданы приборы, позволяющие определять первичную структуру фрагментов генома, синтезировать фрагменты молекул ДНК заданного состава.

В настоящее время многие из генно-инженерных технологий успешно используются в клинико-диагностических исследованиях. Среди них ведущее место принадлежит гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Однако, первыми для решения практических задач медицинской микробиологии были применены методы определения процентного соотношения нуклеотидов в ДНК и молекулярная гибридизация ДНК-ДНК [8, 40]. Основные направления их применения - систематика бактерий и идентификации атипичных штаммов клинических изолятов бактерий. Сотрудниками Нижегородского (Горьковского) НИИЭМ проведено усовершенствование этих методов, позволившее отказаться от использования радиоактивных изотопов и хроматографии на бумаге [40]. 1.1.1 Молекулярное зондирование.

Методы молекулярного зондирования вошли в практику диагностических лабораторий многих стран с середины 70-х годов 20 века, они используются для детекции бактерий и вирусов [6, 19, 37]. Молекулярный зонд - фрагмент ДНК или РНК специфичный участку генома выявляемого объекта. О наличии искомого микроорганизма судят по гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами пробы [204, 221, 223].

Наиболее востребованы в настоящее время два типа зондов: одноцепочечные РНК-зонды. Их получают при синтезе РНК копий с фрагментов ДНК, клонированных в векторные плазмиды с фаговыми промоторами [59]. Мечение происходит в процессе синтеза, что обусловливает его высокую эффективность. РНК зонды не содержат балластных последовательностей, не дают конкурентной гибридизации. Их недостатком является нестабильность, они используются непосредственно после синтеза [59].

Олигонуклеотидные зонды. Одноцепочечные ДНК-зонды размером менее 100 нуклеотидов получают с помощью автоматизированных систем синтеза ДНК. Они объединили в себе преимущества ДНК и РНК зондов: стабильны, эффективно метятся, не дают конкурентной гибридизации, из-за небольшого размера быстро связывается с мишенью, что уменьшает продолжительность исследования. Олигонуклеотидные зонды используются для детекции патогенных микроорганизмов, выявления непротяженных мутаций (нуклеотидных замен, небольших делеций и вставок). Кроме этого они являются компонентами ГТЦР тест-систем и биочипов [223].

Наибольшее распространение получили следующие технологии, основанные на применении зондов:

Гибридизация колоний. При этом варианте исследуемый материал (бактериальные культуры или образцы, их содержащие) выращиваются на мембранном фильтре. Штампом-репликатором на один фильтр наносят от 50 до 120 проб. Лизис клеток и выделение ДНК проводится на фильтре, что существенно упрощает процедуру. Оптимально использование олигонуклеотидных зондов, меченных изотопами фосфора. Гибридизацией колоний достигается высокая производительность, чувствительность, специфичность исследования и сокращается его продолжительность [46]. Гибридизация in situ. Гибридизация зонда проводится с материалом биоптатов, мазков, фиксированных на стекле. Используются любые типы зондов. Предпочтительнее олигонуклеотиды, из-за малых размеров они лучше проникают в ткани и клетки. Чаще применяется флуоресцентная метка. Несмотря на сложность постановки и более низкую чувствительность по сравнению с другими вариантами гибридизации, метод получил широкое распространение при выявлении вирусов, представленных большим числом копий в инфицированных эукариотических клетках [49, 378]. Сэндвич-гибридизация. Особенность данного варианта заключается в использовании двух зондов, гомологичных разным участкам мишени. Один из зондов - улавливающий, наносится на твердый носитель. Он связывает искомую ДНК. После отмывки носитель помещают в раствор второго детектирующего зонда, несущего метку. Сэндвич-гибридизация позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности [49]. Метод разветвленной ДНК. Данный вариант является развитием сэндвич- гибридизации. Искомая нуклеиновая кислота связывается с улавливающим зондом, конец которого комплементарен мишени, а другой конец улавливающего зонда взаимодействует с усиливающим зондом, первый усиливающий зонд связывается еще с одним усиливающим зондом и так далее. Каждый из усиливающих зондов несет несколько меченых группировок, взаимодействуя, зонды формируют каскад усиления сигнала. За счет нескольких улавливающих и усиливающих зондов возможно выявление вирусов с высокой гетерогенностью генома, таких как вирус иммунодефицита человека [49].

Метод биочипов. Биочип представляет собой кварцевую пластинку, на которую нанесено до 400 миниатюрных акриламидных блоков с иммобилизоваными олигонуклеотидными зондами, гомологичными нуклеиновым кислотам патогенных вирусов и бактерий. Результат гибридизации зондов с мишенями фиксируют с помощью люминесцентного микроскопа, сопряженного с компьютером. Одновременно проводится выявление большого количества различных возбудителей. Олигонуклеотидные чипы рассматриваются как одно из наиболее перспективные средств молекулярной диагностики инфекционных заболеваний [49].

Следует признать, что разработка амплификационных методов выявления уникальных фрагментов геномов существенно снизила потребность в тестах, основанных на зондах. 1.1.2. Полимеразная цепная реакция.

Среди амплификационных технологий наибольшее практическое применение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий выявлять единичные молекулы ДНК в пробе предварительно увеличивая их количество.

Принцип ПЦР сформулирован К. Мюллисом в 1983 (в 1993г. он был удостоен за это открытие Нобелевской премии).

ПЦР - метод амплификации ДНК in vitro. С его помощью в течение нескольких часов можно получить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в миллионы раз. Интересующая ДНК- последовательность (мишень) выявляется с помощью двух одноцепочечных олигонуклеотидных ДНК- зондов, получивших название праймеры, которые гомологичны каждый одной из цепей ДНК-мишени. Праймеры ограничивают собой (фланкируют) выявляемый участок и служат затравками для синтеза данного фрагмента [1, 278, 281].

Метод ПЦР открывает широкие возможности в выявлении патогенных вирусов, бактерий, простейших [24]. В качестве мишени для амплификации используются характерные, специфические участки ДНК, являющиеся видоспецифичными для возбудителя - консервативные участки генома, такие как фрагменты генов 168 рРНК, фрагменты генов токсинов. К настоящему времени подобраны праймеры и разработаны тест-системы, основанные на ПЦР, для выявления почти всех практически значимых вирусов, бактерий, грибов, простейших [44, 51, 58, 152, 221, 300, 336].

Наиболее ярко преимущества ПЦР проявились при работе с труднокультивируемыми микроорганизмами: микобактериями [68], микоплазмами [43, 48], лептоспирами, хламидиями [43, 94], легионеллами [152], хеликобактерами [45]. Для ряда вирусов (папилломавирусы, вирусы гепатитов С, в и др.) ПЦР является единственным надежным методом выявления компонентов вирусной частицы [48, 51, 76].

Для решения диагностических задач используются модификации метода ПЦР.

ОТ-ПЦР (обратная транскрипция-ПЦР). Этот вариант ПЦР применяется для выявления вирусов, имеющих геномную РНК [347]. После выделения нуклеиновых кислот из образца проводится синтез к-ДНК так как классические термостабильные полимеразы не синтезируют копий с РНК- матриц. Реакционную смесь после обратной транскрипции используют для постановки ПЦР. В настоящее время открыт фермент ТТН-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза с ревертазной активностью). С ТТН возможно проведение ПЦР-детекции РНК-содержащих объектов одним ферментом в одну стадию в универсальной реакционной смеси, что существенно упрощает процедуру. Однако, данный вариант ПЦР, как правило, уступает классической ОТ-ПЦР по чувствительности [347].

Гнездовая (Nest) ПЦР. Для ПЦР детекции малых количеств микроорганизмов с целью повышения чувствительности и специфичности разработан вариант, получивший название "nest" (гнездовая амплификация) [7, 152]. Процесс проводится в две стадии. Ампликон, синтезированный с использованием первой пары праймеров на первом этапе, служит матрицей и подвергается амплификации с использованием второй пары праймеров на втором этапе. Фрагмент, синтезированный на втором этапе, имеет меньший размер и представляет собой последовательность нуклеотидов центральной части первого фрагмента. За счет двухстадийности повышается специфичность и синтезируется количество ДНК, достаточное для выявления методом электрофореза.

ПЦР с гибридизационно-ферментнъш выявлением ампликона. В данном варианте ПЦР применяются меченые праймеры (метка - биотин, дигоксигенин и ряд других группировок). Продукты амплификации содержат метку. При детекции аликвоты реакционной смеси вносят в лунки планшета с иммобилизоваными ДНК-зондами, гомологичными ампликону. После гибридизации и отмывки визуализируют результат в соответствии со стадиями иммуноферментного анализа, используя конъюгат, соответствующий метке. Учет результата проводят планшетным фотометром. На основе данной модификаци ПЦР разработаны тест-системы для полуколичественного определения инфекционного агента [7].

Мультиплексная ПЦР. С целью снижения стоимости и повышения эффективности исследования разработаны ПЦР тест-системы для выявления в одной реакции несколько инфекционных агентов. При этом используется не одна, а несколько пар праймеров, специфичных к разным объектам. Этот вариант получил название мультиплексной ПЦР.

Праймеры подбирают таким образом, чтобы синтезировались фрагменты различной длины, что позволяет при гель-электрофорезе идентифицировать выявленные объекты.

В мультиплексных системах каждый возбудитель выявляется, как правило, своей парой праймеров. При выявлении нескольких филогенетически близких видов микроорганизмов может быть применен вариант, когда один из праймеров является общим и для каждого вида имеется по одному дифференцирующему праймеру.

Использование мультиплексных систем эффективно, когда выявляемые микроорганизмы не образуют ассоциации. При ассоциациях микроорганизмов возможны ложноотрицательные результаты. Несколько матриц для амплификации приводят к конкуренции за фермент, субстрат, а при использовании общих праймеров - за фермент, субстрат, праймеры. В результате синтезируется фрагмент, матрица которого преобладала в пробе.

Наиболее перспективным для практики является мультиплексная ПНР с выявлением продуктов амплификации методом биочипов. Такая детекция не лимитирует количество выявляемых микроорганизмов и позволяет создать «тематические» диагностикумы: системы для выявления наиболее распространенных и значимых возбудителей НУГИ; всех вирусов группы герпеса, папилломавирусов онкогенных генотипов, основных бактериальных и вирусных возбудителей ОКИ и другие.

ПЦР минипулов. Этот метод применяется при проверке образцов в банках крови стран Европы и США на ВИЧ, вирусные гепатиты В, С для ускорения и снижения стоимости исследования. [48, 83]. В простейшем варианте метода отбирают по 200 мкл из 100 образцов донорской крови, смешивают, 200 мкл этой смеси анализируют в ПЦР. При получении положительного результата первичный пул делится на десять минипулов, по 10 проб в каждом. Вторичные минипулы проверяют на наличие инфекционного агента. В минипулах с положительными результатами исследуется каждый образец.

ПЦР в реальном времени (Real time PCR). Наиболее важным достижением последних лет в развитии ПЦР является разработка технологии, получившей наименование Real time PCR - ПЦР в реальном времени. В отличие от классического в этом методе отсутствует этап выявления продукта амплификации.

Реакционная смесь данных тест-систем укомплектована таким образом, что параллельно с нарастанием количества ампликонов происходит увеличение сигнала флюоресценции [127, 174, 195, 320]. Амплификаторы для проведения ПЦР в реальном времени кроме функции поддержания температурно-временного режима регистрируют величину флюоресценции.

ПЦР в реальном времени имеет следующие преимущества: -возможна оценка количества инфекционного агента, поскольку уровень сигнала флюоресценции зависит от исходной концентрации ДНК мишени; -отсутствует контаминация ампликонами, так как пробирки с реакционными смесями не открывают;

-уменьшается продолжительность исследования.

Имеется вариант, сочетающий в себе элементы ПЦР в реальном времени и классической технологии, получивший наименование «End point». В этом случае используют тест-системы для ПЦР в реальном времени, а реакция проводится в обычном амплификаторе. После завершения ПЦР проводят измерение конечного уровня флюоресценции на флюориметре, разработанном под формат микропробирок, и сравнивают полученный результат с отрицательным контролем. «End point» более доступен, так как стоимость амплификатора и флюориметра существенно ниже, чем у амплификатора для Real time PCR.

Кроме ПЦР имеются другие технологии, использующие принцип амплификации нуклеиновых кислот - лигазная цепная реакция (ЛЦР) [7, 152]. Транскрипционная амплификация (Qß-амплификация, NASBA и др.) [48, 152], но их практическая значимость существенно меньше.

1.1.3. Сложности, возникающие при использовании ПНР в практической диагностике.

Следует отметить, что наряду с неоспоримыми преимуществами перед другими методами детекции микроорганизмов, ПЦР и другие технологии, использующие принцип амплификации нуклеиновых кислот, имеют ряд недостатков, осложняющих их внедрение в практическую диагностику.

Создание ПЦР-лаборатории влечет за собой приобретение большого количества дорогостоящего оборудования, которого, как правило, не имеется в типовой бактериологической лаборатории.

Согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» ПЦР-лаборатория размещается минимум в двух, а лучше в трех изолированных помещениях (по одному для каждой стадии метода) [66].

При использовании матричного синтеза ДНК и РНК имеется вероятность ложноположительных результатов за счет контаминации исследуемых проб и реактивов ампликонами или исходной ДНК-матрицей. Возможны два варианта контаминации:

- тотальная контаминация вызывается загрязнением реактивов для обработки проб и проведения ПЦР ампликонами, микроорганизмами или их ДНК. При такой контаминации получаются только положительные результаты. Правильная планировка лаборатории, соблюдение требований упомянутых выше Методических рекомендаций существенно снижает вероятность тотальной контаминации. Если она произошла, необходимо заменить все реактивы и провести тщательную обработку рабочих помещений. В лабораториях с высоким уровнем подготовки специалистов случаи тотальной контаминации редки. Достижения последних лет (антиконтаминационная модификация ампликонов, технологиий ПЦР в реальном времени и «End point») сводят до минимума вероятность тотальной контаминации.

-спорадическая контаминагщя обусловлена попаданием микроорганизмов, их нуклеиновых кислот, продуктов амплификации в отрицательные пробы. От данной контаминации не застрахована ни одна лаборатория, поскольку сложно установить сам ее факт. Одним из ее признаков является значительное, нелогичное увеличение количества положительных результатов. Небрежность при отборе проб, транспортировке материала, выделении нуклеиновых кислот, постановке ПЦР может привести к спорадической контаминации. Для ее профилактики необходимо повышать квалификацию сотрудников ПЦР-лабораторий.

Таким образом, современные амплификационные и гибридизационные технологии за счет повышения чувствительности, специфичности, объективности и технологичности исследований позволяют поднять на новый уровень диагностику инфекционных заболеваний. При этом следует учитывать, что успех ДНК-РНК диагностики зависит от интеграции новейших достижений с традиционными методами исследования. В связи с этим, наиболее перспективны многопрофильные научно-методические комплексы, способные на высоком уровне выполнять клинико- биохимические, микробиологические, иммунологические и молекулярно- генетические исследования.

1.2. Современная лабораторная диагностика ряда актуальных бактериальных и вирусных инфекций 1.2.1 Диагностика бактериальных ОКИ.

Большая часть бактериальных возбудителей ОКИ - бактерии родов Shigella, Salmonella, Escherichia, Yersiniae являются классическими объектами медицинской микробиологии. Они хорошо культивируются в лабораторных условиях.

Бактериологический метод в связи с этим является базовым для детекции и идентификация бактериальных возбудителей ОКИ. Определение родовой и видовой принадлежности изолятов проводится по биохимическим тестам, для подтверждения идентификации используется серотипирование с родоспецифичными и видоспецифичными антисыворотками. Эпидмаркирование штаммов осуществляется за счет дополнительных биохимических тестов, фаготипирования, бактериоцинотипирования. Имеются официальные методические указания, регламентирующие микробиологическую диагностику заболеваний, вызванных энтеробактериями.

Единственными труднокультивируемыми микроорганизмами среди бактериальных возбудителей ОКИ являются представители рода Campylobacter. Для их культивируются в лабораторных условиях требуются сложные, дорогостоящие питательные среды и анаэростаты. В разделе 1.2.2 «Диагностика хеликобактерной инфекции» подробно изложены условия культивирования микроаэрофилла H.pylori - микроорганизма, близкородственного кампилобактерам.

Бактериологический метод является основным и доминирующим при выявлении бактериальных возбудителей ОКИ. Вместе с тем имеются характеристики, ограничивающие его возможности. Одним из недостатков бактериологического анализа является продолжительность, составляющая 5­7 дней. Поэтому разработка методов быстрого выявления энтеробактерий, является актуальной. Системы для экспресс-индикации этих возбудителей, основанные на иммунологических методах, не нашли применения в практике из-за неспецифических перекрестных реакций, обусловленных наличием общих и сходных антигенов у различных представителей семейства Enterobacteriaceae.

Молекулярно-биологические методы диагностики бактериальных возбудителей ОКИ.

Экспрессное выявление бактериальных возбудителей ОКИ стало возможным благодаря использованию молекулярно-биологических методов, главным образом, ПЦР. С их помощью в значительной мере удалось разрешить проблему обнаружения факторов патогенности у штаммов энтеробактерий, которая не решалась традиционными методами исследования.

Разработка в 80-е годы молекулярных зондов, специфичных в отношении кластера генов ipa А, В, С, D, Н оперона инвазивности послужила отправной точкой для подбора участка-мишени и праймеров для индикации шигелл и энтероинвазивных E.coli методом ПЦР [232, 335].

Первые публикации о применении ПЦР для детекции энтеробактерий появились в конце 80-х годов 20 века. Новые тест-системы позволяли быстро и эффективно выявлять шигеллы по наличию факторов патогенности: генов инвазивности [335, 232] и гена шигатоксина [206, 226]. Впоследствии были разработаны ПЦР тест-системы для выявления гена шигаподобного токсина у энтеротоксигенных эшерихий [207, 279]. Это позволило обнаруживать токсинпродуцирующие E.coli у больных и в объектах окружающей среды [247,313,350].

Много работ посвящено ПЦР детекции Е. coli 0157-Н7, которые вызывают в разных странах вспышки ОКИ с геморрагическим синдромом, и могут быть причиной смерти заболевших [266, 302, 371]. Разработан экспресс вариант ПЦР в реальном времени для мультиплексного анализа на наличие генов шигатоксинов stxl и stx2. Он применяется для тестирования проб фекалий больных ОКИ и позволяет выявить токсигенные эшерихии в тех образцах, которые дали отрицательный результат при культуральном исследовании [116].

Метод ПЦР широко используется в диагностике ОКИ, получившей название «диарея путешественников». Её возбудителем являются E.coli, продуцирующим термолабильный (LT) и термостабильный (ST) токсины. В качестве мишени для амплификации используют фрагменты генов этих токсинов [104, 170].

В начале 90-х годов появляются публикации о применении метода ПЦР для детекции сальмонелл [95, 156, 227]. Way J.S. с соавторами была создана мультиплексная ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella [369]. В ней используются 3 пары праймеров: одна из них специфична к фрагменту гена, общего для сальмонелл, шигелл и эшерихий и служит для детекции энтеробактерий трех родов. Две другие пары специфичны для генов бактерий рода Salmonella. Таким образом, в образце выявляются представители семейства Enterobacteriaceae, и отдельно - сальмонеллы.

В 90-е годы 20 века также были разработаны ПЦР тест системы для выявления бактерий рода Campylobacter и бактерий Yersinia eterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis [152, 300].

В настоящее время при диагностике ОКИ чаще применяют тест - системы мультиплексного формата, позволяющие выявлять несколько инфекционных агентов [97, 331, 363].

Oyofo с соавторами предложна мультиплексная система для одновременного выявления энтеротоксигенных E.coli, бактерий родов Shigella и Campylobacter [294].

В Корее разработан вариант «Real time» ПЦР с использованием интеркалирующего красителя sibre Green для одновременного выявления virA гена Shigella flexneri и invA гена Salmonella typhimurium в фекалиях. Этап выделения ДНК отсутствует. Чувствительность метода составила 40 кл/гр фекалий [364]. Мао Н. с соавторами предложена мультиплексная ПЦР тест-система для выявления гена uidA Е. coli. 0157:Н7, invA гена Salmonella ssp. и ipaH гена Shigella ssp. Разделение продуктов ПЦР осуществляется методом капиллярного электрофореза в акриламидном геле [254].

В Индии с использованием мультиплексных ПЦР тест систем выявлялись диареегенные бактерии в пробах фекалий от больных дошкольников (780 проб). Наиболее часто обнаруживались энтероинвазивные E.coli (8,2%), энтеропатогенные E.coli (3,5%), энтеротоксигенные E.coli (1,3%). Энтерогемораргические E.coli, бактерии Shigella spp, Vibrio cholerae и Salmonella обнаружены в единичных случаях [106].

При исследовании 300 фекальных проб от больных диареей детей в

Мексике методом мультиплексной ПЦР бактерии рода Salmonella выявлены в 53,5% случаев, диареегенные E.coli -в 33,2%, бактерии рода Shigella - в 2,6%. Все исследованные образцы содержали один или несколько видов возбудителей [296].

Осуществлялось сравнение эффективности бактериологического метода и метода ПЦР. В Бангладеш проведено параллельный анализ фекалий больных дизентерией бактериологическим методом и ПЦР. Для проб, из которых выделены шигеллы, получен положительный результат и в ПЦР. Методом ПЦР шигеллы были выявлены в ряде проб, отрицательных в бактериологическом анализе. Чувствительность бактериологического исследования составила 72%, а ПЦР — 100%. Метод ПЦР был предложен авторами для рутинной диагностики кишечных инфекций [205].

В Таиланде проведено сравнение бактериологического метда и ПЦР при контроле эффективности антибиотикотерапии больных шигеллезом. Метод ПЦР был более чувствительным и информативным. Он выявлял шигеллы у больных на фоне антибиотикотерапии при отсутствии диареи [329].

При обследовании 150 детей с острым гастроэнтеритом в Палестине традиционным методом и ПЦР результаты совпали. Бактериальные возбудители ОКИ обнаружены в 17.3 % образцов (Shigella spp - 6,0 %), Campylobacter coli/jejuni - 4.7 %, Escherichia coli 0157:H7 - 4.7 %, Salmonella spp - 2,0 %). Авторы считают целесообразным комбинирование традиционных и молекулярных методов при диагностике бактериального гастроэнтерита [296].

Метод ПЦР активно используется для проверки контаминации продуктов питания, пищевого сырья, воды энтеробактериями. Wang R.F. с соавторами разработана ПЦР тест-система, позволяющая проводить экспресс-детекцию 13 патогенных микроорганизмов (в основном возбудителей ОКИ) в продуктах питания [364].

Мультиплексная тест-система была использована для детекции сальмонелл и шигелл при обследовании моллюсков в Греции [357].

Были сконструированы праймеры для детекции wee гена, входящего в состав кластера, ответственного за продукцию общего энтеробактериального антигена (ЕСА), который является типовым признаком для всех представителей семейства Enterobacteriaceae. Авторы предложили использовать эти праймеры для тестирования контаминации питьевой воды и пищи энтеробактериями на первом этапе исследования. В случае положительного результата предлагается проводить ПНР идентификацию энтеробактерий Е. coli 0157:Н7, Shigella spp, Salmonella spp и Yersinia spp.

Тайваньскими учеными разработан метод выявления малых количеств бактерий рода Shigella в природной воде. 50 мл воды фильтруют. Материал фильтра подвергают ПЦР. Чувствительность метода составила 270-8000 клеток на 50 мл воды [201].

Таким образом, несмотря на доминирование микробиологических методов, являющихся информативными и доступными, метод ПЦР достаточно широко используется в диагностике ОКИ [65]. Он незаменим при исследованиях большого количества проб продуктов питания, объектов внешней среды и материалов от больных при расследовании вспышечной и спорадической заболеваемости, для выявления штаммов, продуцирующих токсины и другие факторы патогенности, представляющие особую опасность.