2.1.2. Методы.

Микробиологические методы

Выявление бактерий родов Shigella, Salmonella проводили согласно Методическим указаниям, регламентирующим микробиологическую диагностику заболеваний, вызванных энтеробактериями (Москва, 1984 г.). Для выявления и культивирования U. urealyticum, М. hominis использовали дифференциально-диагностические среды фирмы «Диагност» (г. Омск) и клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева (г. Москва).

Объекты и объем исследований

Визуализацию клеток Н. pylori осуществляли при изучении парафинизированных срезов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки [4]; исследовании мазков отпечатков биоптатов слизистой желудка и

двенадцатиперстной кишки [3]; микроскопировании отпечатков пристеночной слизи желудка и двенадцатиперстной кишки [56].

Иммунологические методы.

Выявление антигенов вируса гепатита В, антител к вирусам гепатитов В, С, D, G; цитомегаловирусу, герпесу простому I и II типов, С. trachomatis проводили методом ИФА, Использовали тест-системы фирм «Диагностические системы» (г. Н. Новгород), «Имбио» (Н. Новгород), «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Выявление антигена С. trachomatis проводили методом ПИФ. Использовали тест-системы фирмы «Ниармедик» (г. Москва).

Молекулярно-биологические методы

При проведении работ с ДНК зондами для выделения хромосомных и плазмидных ДНК, выделения фрагментов ДНК из плазмид, проведения препаративного гель-электрофореза, трансформации плазмидной ДНК в бактериальные клетки, введения метки в состав зондов, проведения дот- гибридизации, гибридизации колоний использовали методы, предложенные в руководстве Маниатис с соавт. [46] Варианты подготовки материала для проведения ПЦР.

Для подготовки клинических проб к проведению ПЦР использовался метод ферментативного лизиса и фенольно-хлороформной депротеинизации в модификации Марковой [47].

Выделение ДНК с помощью наборов «ДНК-сорб А», «ДНК-сорб Б», и выделение РНК с помощью набора «Рибо-сорб-50» разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора проводили в соответствии с наставлением по применению.

ДНК, очищенная любым из методов, хранится до недели при плюс 2-8° С и до года при минус 20° С. РНК не хранится и непосредственно после выделения используется для получения кДНК в реакции обратной транскрипции.

Амплификации фрагментов генома энтеробактерий

Выявление генов ЬТ, £Т, УТ1 токсинов и гена оперона инвазивности энтеробактерий с использованием экспериментальных ПЦР тест-систем разработки ФГУН ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (авторская разработка).

1. Готовили реакционную смесь для амплификации из расчета на 1 пробу:

2,5 Мкл праймеров по 5-15 пмоль/мл каждого; 5 мкл 10-кратного реакционного буфера 2,5 мкл dNtp по 1мМ каждого; 1 мкл Tag-пoлимepaзы 0,5 е.А. 29 мкл деионизованной воды

2. После добавления Тад-полимеразы, которое производилось в последнюю очередь ,тщательно перемешивали смесь пипетированием.

3. Добавляли по 40 мкл смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации, наносили по 25-30 мкл минерального масла

4. Вносили по 10 мкл анализируемых образцов и контролей в соответствующие пробирки под слой масла.

5. Пробирки с реакционными смесями помещали в амплификатор и проводили амплификацию в режиме матричного регулирования процесса.

1) программа амплификации фрагмента оперона инвазивности (1пу) и фрагмента гена шигаподобного токсина (УТ1):

«горячий старт»	94°С 3 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	94°С 1 мин. 55°С 1 мин. 72°С 1 мин.	30 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
завершение синтеза	72°С 5 мин.	1 цикл

2) программа амплификации фрагмента гена термостабильного токсина (ST): «горячий старт»	94°С 3 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	94°С 1 мин. 48°С 1 мин. 72°С 1 мин.	30 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
завершение синтеза	72°С 5 мин	1 цикл
3) программа амплификации фрагмента гена термолабильного токсина (LT):
«горячий старт»	94°С 3 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	94°С 1 мин 53°С 1 мин 72°С 1 мин.	30 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
завершение синтеза	72°С 5 мин	1 цикл

Выявление бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia с использованием экспериментальной тест-системы «Amply-Inv» совместной разработки ФГЪ^ГН ННИИЭМ им. им. акад. И.Н. Блохиной Роспртребнадзора и ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Тест-система основана на принципе «буст»-амплификации с использованием внешних и внутренних пар праймеров.

1. В микропробирки согласно количеству исследуемых образцов и контролей вносили по 5 мкл нижней реакционной смеси (раствор праймеров 5-15 пмоль/мл каждого; раствор dNTP- по 1мМ каждого). На поверхность нижнего слоя наносили расплавленный воск, остужали до образования восковой перегородки.

2. Не повреждая перегородку, в каждую пробирку вносили по 10 мкл верхней реакционной ПЦР-смеси следующего состава: 0,05 мл фермента Taq- полимераза, 0,45 мл деионизованной воды, 0,5 мл 5-кратного буферного раствора (0,335М трис-HCl рН 8,0; 0,0125 М MgCl₂; 0,625 г/л БСА; 40 % глицерин; 0,0625 % ксиленцианол).

3. Вносили в пробирки по 30 мкл стерильного минерального масла.

4. Добавляли в пробирки в соответствии с маркировкой под слой масла по 10 мкл исследуемых проб, положительных и отрицательных контролей.

5. Проводили реакцию на амлификаторе «Терцик» МС2» согласно программе в режиме активного прецезионного регулирования процесса:

«горячий старт»	95°С Змин	1 цикл
денатурация ДНК	95°С 15 сек. 65°С 15 сек. 72°С 15 сек.	10 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
денатурация ДНК	95°С 11 сек. 55°С 11 сек. 72°С 11 сек.	30 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
завершение синтеза	72°С 5 мин.	1 цикл

Выявление бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia с использованием тест-системы «АмтиСенс-100-R Shigella species» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

ПЦРдетекция бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia с использованием тест-системы «АмплиСенс-100-R Shigella species» проводилась согласно инструкции производителя.

Выявление бактерий родов Salmonella, Campylobacter, Y. enterocolitica с использованием тест-систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

ПЦР-детекция бактерий родов Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica с использованием тест-систем производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора проводилась в соответствии с наставлением по применению.

Выявление бактерий родов Salmonella с использованием ПЦР тест-системы фирмы «Ниармедик» Москва.

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме:

1. Приготовить в микропробирке объемом 1,5 мл (тип «Эппендорф») реакционную смесь, для этого смешать следующие компоненты в расчете на 1 исследование:

5 мкл деионизованной воды

2,5 мкл 10-кратного буфера (67 мМ Трис рН 8,8; 16,6 мМ (№[4)2804; 6,7 мМ 1\^С1₂; 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 6,7 мМ ЭДТА; 1мкл раствора БСА; 1,5 мкл раствора сШТР;

3 мкл раствора праймеров — по 1,5 мкл каждого;

2. Разнести реакционную смесь в 0,5 мл микропробирки (тип «Эппендорф») по 13 мкл, согласно количеству исследуемых образцов и контролей.

3. Наслоить на поверхность каждой реакционной смеси по 30 мкл стерильного вазелинового масла.

4. Внести в пробирки под масло по 10 мкл проб и контролей согласно маркировке.

5. Поместить пробирки в амплификатор, денатурировать нагреванием при 94° С в течение 4 мин.

6. На стадии паузы добавить в каждую пробирку по 2 мкл разведенной непосредственно перед употреблением бидистиллированной водой Tag- полимеразы (2 единицы активности).

7. Провести амплификацию по следующей программе,

горячии старт	94°С 4 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	94°С 1 мин. 57°С 1 мин. 72°С 1 мин.	35 циклов
отжиг праймеров
синтез фрагмента

Выявление генов LT, ST, VT1 и VT2 токсинов энтеробактерий с использованием ПЦР тест-систем серии "E.coli tox " ФГУН ЦНИИЭ

Роспотребнадзора.

ПЦР-детекция генов ЬТ, БТ, УТ1 и УТ2 токсинов энтеробактерий с использованием ПНР тест-систем серии "Е.соН 1:ох " (ЦНРШЭ Роспотребнадзора) проводилась в соответствии инструкций производителя.

Детекция фрагментов генов патогенности холерных вибрионов у энтеробактерий с использованием ПЦР тест-системы производства НИИММО РФ г. Киров.

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований)исследование проводили по следующей схеме:

1. В микропробирки согласно количеству исследуемых образцов и контролей вносили по 5 мкл нижней реакционной смеси (раствор праймеров 2,5мкл каждого; раствор 2,5 мкл). На поверхность нижнего слоя наносили расплавленный воск, остужали до образования восковой перегородки. Для каждой пробы готовили по пробирке с нижней реакционной смесью для выявления гена с1хА, детерминирующего синтез субъединицы А холерного энтеротоксина и с нижней реакционной смесью для выявления гена 1:срА, кодирующего синтез основной субъединицы пил ей адгезии.

2. Не повреждая перегородку, в каждую пробирку вносили по 10 мкл универсальной верхней реакционной ПЦР-смеси производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

3. Вносили в пробирки по 30 мкл стерильного минерального масла.

4. Добавляли в пробирки в соответствии с маркировкой под слой масла по 10 мкл исследуемых проб, положительных и отрицательных контролей.

5. Проводили реакцию на амлификаторе «Терцик»МС2» согласно программе в режиме активного прецезионного регулирования процесса:

горячий старт	95°С 5 мин.	1 цикл
денатурация ДНК	95°С 20 сек. 53°С 20 сек. 72°С 20 сек.	40 циклов
отжиг праймеров
синтез фрагментов
завершение синтеза	72°С 2 мин.	1 цикл

Амплификация фрагментов генома H.pylori.

Выявление H.pylori с использованием ПЦР тест-системы «Helicobacter» фирмы «Ниармедик» (Москва).

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме:

1. Готовили в микропробирке объемом 1,5 мл (тип «Эппендорф») реакционную смесь, для этого смешивали в расчете на 1 исследование:

2,5 мкл 10-кратного буферного раствора;

1,5 мкл раствора БСА с концентрацией 17 мг/мл;

2. мкл смеси dNTP

4 мкл раствора праймеров - по 2мкл каждого,

2. мкл деионизованной воды.

1. Разносили реакционную смесь в 0,5 мл микропробирки по 16 мкл, согласно количеству исследуемых образцов и контролей.

2. Наслаивали на поверхность каждой реакционной смеси по 30 мкл стерильного вазелинового масла.

3. Вносили под масло по 7 мкл проб и контролей согласно маркировке.

4. Помещали смеси в амплификатор, денатурировали нагреванием при 95° С в течение 4 мин.

5. На стадии паузы добавляли в каждую пробирку по 2 мкл разведенной непосредственно перед употреблением бидистиллированной водой Tag- полимеразы (2 единицы активности).

6. Проводили амплификацию по следующей программе:

денатурация ДНК	94°С 1 мин.
отжиг праймеров	66°С 1 мин.	35 циклов
синтез фрагмента	72°С 2,5 мин.

Выявление Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс- НеИсоЬа^ег ру1оп-520» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

ПЦР-детекция Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс-НеПсоЬайег ру1оп-520» ФГУН ЦР1ИИЭ Роспотребнадзора проводилась согласно инструкций производителя.

Выявление Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол II» фирмы Литех г. Москва.

ПЦР детекция Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол II» фирмы Литех г. Москва проводилась в соответствии с инструкциями производителя.

Амплификация гена CagA Н.ру1оп с помощью тест-системы «ДиаГен- НеИсоЬаМег» фирмы «Диагенис» г. Москва.

ПЦР детекция гена CagA Н.ру1оп с помощью тест-системы «ДиаГен- НеНсоЬас1ег» фирмы «Диагенис» г. Москва проводилась согласно инструкций производителя.

Амплификация гена УасА Н.ру1оН с использование набора «Хеликопол УА» фирмы Литехг. Москва.

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме: