Фільтрувальне обладнання вибираємо за поверхнею фільтрації і за питомою швидкістю фільтрації.

S = Q₂/g₁ x t ₆=30/3,01×0,05×2×20=4,9=5 м²,

де S - необхідна поверхня фільтрації, м²;

Q₂- кількість культуральної рідини за добу, м³;

g₁ -питома швидкість фільтрації;

₆ - час роботи фільтра - 20 годин (для даного конкретного випадку).

Приймаємо центрифугу з поверхнею фільтрації S=5 м² і одну запасну.

де Q₂- кількість культуральної рідини за добу, м³;

0,5 - гідромодуль при промивці;

k - коефіцієнт, що враховує вихід фільтрату на стадії.

Збірник після центрифугування

Кількість вихідного об’єму після центрифугування складатиме 36,169 м³

Необхідний об’єм збірника при коефіцієнті заповнення 0,8

Q₁₂ =36,169/ 0,8 = 44,9 м³

Встановлюємо 3 збірники V=15 м³ та один запасний

2.Розрахунок допоміжного обладнання

Насоси

Вибираються по продуктивності та по величині напору, яка враховує перепад висоти лінії подачі матеріалу з одної місткості в іншу:

Q_н = Q /  =30/2=15 м³/год,

де Q – кількість продукту , яке потрібно перекачати насосом;

 - час роботи насоса (цей час не перевищує 2 –2,5 години).

Бункери

Приймальні бункери для сипких компонентів поживного середовища вибирають по розрахованій місткості або з типового обладнання. Бункери, на відміну від силосних башт, які слугують для тривалого зберігання речовини та встановлені поза межами цеху, розташовують поблизу ділянки приготування поживного середовища (відділення приготування поживного середовища). Бункери передбачають, що найменше 2 – 2,5 добовий запас сировини.

Місткість бункера (V₆) розраховується за формулою:

V₆ = Q /k ×n=0,43/0,8×1,6=0,3 м³

де – Q – кількість продукту для зберігання (2 – 2,5 добовий запас),т;

k – коефіцієнт заповнення бункера;

n – густина продукту, т/м³.

Встановлюємо бункер об’мом 1 м³.

Місткості для допоміжних розчинів

Допоміжні місткості представлені дозаторами титрувальних розчинів, напірними місткостями піногасника, дозаторами підживлення тощо. Місткісне обладнання для цих розчинів повинно містити 5 – добовий запас компонента.

V_г = Q / k =15/0,8=18,75 м³.

де – Q – об’єм розчину 5 добовий запас,т;

k – коефіцієнт заповнення місткості.

2.6. Контроль виробництва

Для забезпечення відповідності готової продукції вимогам НТД на підприємстві забезпечується (моніторинговий - постійний постадійний) контроль процесу та контроль готової продукції.

Контроль посівного матеріалу

Споровий посівний матеріал перед використанням у виробництві піддають мікробіологічному і біохімічному контролю. Перевіряють мікробіологічну чистоту, морфологічну однорідність, здатність до спороутворення, кількість в 1 г посівного матеріалу, а також активність до біосинтезу антибіотиків [4].

Для контрольної перевірки від кожної партії відбирають спори в кілька прийомів, середню пробу в кількості 1% загальної маси. За результатами контролю середньої проби судять про якість всієї партії [4].

Партією вважається кількість спор, вирощених одночасно і оформлених одним документом [4].

Мікробіологічний контроль

Служить для встановлення мікробіологічної чистоти та морфологічної однорідності посівного матеріалу і здійснюється методом розливу спорової суспензії на чашках Петрі з сусло-агаром (СА) м'ясо-пептоним агаром (МПА) або рибо-пептоним агаром (РПА) [4].

Для аналізу беруть наважку спор до 35 мг і висівають на 80-90 чашках Петрі з СА і 10-20 чашках з 1 МПА або РПА. Випробуваний споровий матеріал розводять так, щоб густина зростання була не меньше 40-60 колоній на чашку [4].

Чашки з СА витримують у термостаті при 32 ° С протягом 5-6 діб, з МПА при 37 ° С 1-2 доби. На 4 і 6-у добу після посіву чашки переглядають, визначаючи однорідність (відсутність форм мінливості штаму) і чистоту культури (відсутність бактерій, дріжджів і кольорових цвілі). При виявленні неактивних форм мінливості штаму більш ніж на 0,2% або сторонньої мікрофлори посівний матеріал бракується [4].

Визначення здатності спор до проростання

На предметному склі за допомогою спеціальних кілець готують вологу камеру. Спори пророщують у висячій краплі суслового або мелясного розчину, приготованого так само, як і для біохімічного контролю, але додатково профільтрованого і простерилізуваного протягом 30 хв під тиском в 1 атм. Спорову суспензію готують у такому розведенні, щоб у краплі було 10-15 спор. Час пророщування 9 годин при 32 ° С [8].

Загальна кількість переглянутих спор в кожній партії 400-600. Підрахунком встановлюють кількість пророслих і непроросшіх спор. Схожість - це відношення пророслих спор до загальної кількості переглянутих, виражене у відсотках, Схожість довжки бути не вище 90% [8].

Проводять визначення кількості спор в 1 г посівного матеріалу. Кількість спор у 1 г посівного матеріалу має бути не менше 10,0 мільярдів [8].

Стерильність процесу

Строго обов'язковою умовою приготування посівного матеріалу є оберігання його від забруднення сторонньою мікрофлорою тому всю роботу необхідно здійснювати в стерильних умовах [4].

Повітря робочих приміщень повинно бути практично стерильним, без пилу і мікроорганізмів, особливо без цвілі, що забруднюють розливання. Стерилізацію повітря проводять за допомогою ртутно-кварцових або бактерицидних (ОБПе-450) ламп і пульверизацією розчинів антисептиків, з подальшим миттям підлоги.

Стіни, підлоги і все обладнання приміщень обробляють 5%-вим розчином перекису водню або іншими дезінфікуючими засобами [4].

Чистоту повітря перед роботою перевіряють висівом на чашках Петрі з сусло-агаром і м'ясо-пептоним агаром протягом 10 хв [4].

Особливу увагу слід звертати на приготування та стерилізацію поживних середовищ [4].

Якісна оцінка культури до синтезу авермектинів

Якісну оцінку здатності культури до синтезу авермектинів проводили методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на сілікагелевих пластинах Sorbfil (виробник АО “Сорбполімер”, Росія) в системі гексан-ацетон-етанол (56:24:4. Хроматограми проявляли шляхом їх обробки 0,75%-вим розчином перманганату калію протягом 5 хв. Контролем був стандартний розчин авермектинів “Аверсектин С” для хроматографії виробництва НВО “Фармбіомед”. За плямами, що утворились на хроматографічних пластинках, встановлювали наявність компонентів авермектинів в досліджуваних екстрактах [8].

Визначення концентрації авермектинів

В. А. Мосіним з соавторами розроблений колориметричний метод визначення авермектинів, заснований на вимірі оптичної густини продукту взаємодії авермектинів з орцином в органічній фазі при λ 630 – 640 нм. Цей метод застосовується для визначення авермектинів в екстрактах культуральної рідини Streptomyces avermitilis та в кристалічних препаратах. Відносна похибка методу складає 4–8 %. В якості стандарту використовується препарат авермектину виробництва фірми Merck (США). До складу авермектинів входить дидезоксицукор. Представлений дисахаридом L-олеандрозою. Описано багато кольорових реакцій на дезоксицукри, але всі реакції адаптовані для проведення аналізу у водній фазі. Так як авермектини відрізняються низькою розчинністю у воді, для їх екстракції з міцелію застосовують органічні розчинники, які змішуються з водою: ацетон, метанол, етанол. Тому з ціллю розробки колориметричного методу визначення авермектинів проведено вибір хімічної реакції на вуглеводний компонент, що дає кольоровий комплекс з авермектинами. Оптимальна органічна фаза для проведення реакції Біаля з авермектинами є н-бутанол, оптимальні умови – нагрівання протяном 15 – 20 хв. При температурі +75…+80°С. Реакція дуже чутлива до дуже низьких концентрацій авермектинів, що дозволяє визначати їх вміст до 1 мкг/мл [16]. Метод включає наступні етапи: оримання вологого осаду міцелію шляхом центрифугування при 3000 об/хв. Протягом 20 хв; промивання осду міцелію дистильованою водою при +7…+10°С в кількості, що відповідає кількості кільтуральної рідини взятої для аналізу, протягом 5 хв; осадження промитого міцелію центрифугуванням при 3000 об/хв. протягом 10 хв; отримання етанольного або ацетатного екстрактів авермектинів при кімнатній температурі протягом 20 хв при постійному перемішуванні; розведення екстракту до концентрації авермектинів 2 – 20 мкг/мл у 2–50 %-му етанолі або 0,2–2 %-вих ацетоні або н-бутанолі; провелення кольорової реакції в пробірках, що містять по 2 мл стандартного розчину авермектинів, 2 мл орцинового реактиву і 1 мл н-бутанола. Проби ретельно перемішати. Одночасно готується контрольний розчин, де замість авермектинів використовується н-бутанол. Пробірки поміщають на водяну баню (+75…+80°С) і витримують 15 – 20 хв. Після інкубації при вказаних умовах, визначають значення оптичної густни на ФЄК 56 – М . Вміст авермектинів оцінюють по значенню оптичної густин за допомогою калібрувального графіка [16]. Даний метод підходить для використання як до кристалічних препаратів так і культуральної рідини. Перевагою даного методу перед відомими є низька собівартість проведення аналізу. Це дуже вигідно при оперативному контролі процесу промислової ферментації, направленої селекції продуцентів та ін. [16].

Визначення аутентичності авермектинів

Аутентичність авермектинів встановлювали методом тонкошарової хроматографії з використанням пластинок “Silufol” фірми “Merk”. Вміст авермектинів в екстрактах з культуральної рідини S. avermitilis визначали колориметричним методом при взаємодії авермектинів з орцином в органічній фазі. Концентрацію авермектинів виражали в мікрограмах на см³ спиртового екстракту, одержаного за стандартною методикою (мкг/см³) або в мікрограмах на см³ культуральної речовини – вологої чи висушеної біомаси продуцента авермектинів [8].

Визначення вмісту окремих авермектинів

Вміст окремих авермектинів в авермектиновому комплексі визначали на рідинному хроматографі високого тиску “Waters 990” фірми “Мілліпор” (США) при порівнянні із стандартними зразками авермектинів А_1а, А_2а, В_1а, В_2а, А_1в, А_2в, В_1в, В_2в [8].

Визначення вітамінів та амінокислот

Вітаміни групи В встановлювали мікробіологічними методами. Вміст амінокислот визначали на амінокислотному аналізаторі АКА – 339, вміст органічних кислот - за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на хроматографі “Laboratorni Pristroje” [8].

Визначення компонентного складу та співвідношення окремих фракцій

Компонентний склад авермектинового комплексу та співвідношення окремих фракцій у відсотках до загальної їх кількості визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) у системі етанол – ацетонітрил – вода (55:22,5:22,5) на приладі Beckman System Gold [8].

Ліпіди міцелію S. avermitilis УКМ Ас-2177 досліджували методом Фолча, модифікованим в лабораторії “Produsi microbieni” Інституту мікробіології АН республіки Молдова [8].

Кількісний та якісний склад ліпідів визначали методом тонкошарової хроматографії на пластинках “Silufol” марки UV-254 в системі гексан – диетиловий ефір – льодяна оцтова кислота (73:25:5). Проявлення ліпідів на хроматограмах проводили шляхом їх обробки 10%-вим етанольним розчином фосфомолібденової кислоти. Аналіз спектрів ліпідних фракцій проводили за допомогою комп’ютерної програми Total Lab[8].

Аналіз жирнокислотного складу ліпідів проводили на газовому хроматографі НР 6890 за ГОСТ Р 1486-99 [8].

Встановлена пряма залежність між синтезом ліпідів і авермектинів – при збільшенні кількості ліпідів в біомасі стрептоміцету збільшувалося накопичення ним авермектинів [8].

Визначення активності авермектинів

Активність визначали мікробіологічним методом. Визначення здійснюється шляхом порівняння ступеня пригнічення росту чутливих мікроорганізмів випробуваного і стандартного зразків у певних концентраціях [2].

Ефективність дії препарату проти нематод Meloidogyne incognito вивчали в лабораторних умовах. За контроль правив стандартний розчин авермектинів (2 мкг/мл) [2]. Найнижча з узятих в дослід концентрацій препарату (0,1 мкг/мл) починала діяти на тест-об’єкт на 3 год. досліду, і викликала за цей період загибель 50-53% нематод, від загального числа особин, взятих у дослід. За 4 год. загинуло 60% нематод [2]. Повну загибель нематод спостерігали при концентрації препарату 2 мкг/мл за 4 год., що співпадало з дією авермектину за тих же умов [2].

Основний мікробіологічний контроль

Здійснюється на основних стадіях проведення процесу (після проведення стерилізації спецодягу; підготовка основного та допоміжного обладнання до роботи; очистка повітря в індивідуальних фільтрах; стерилізація піногасника; підготовка та стерилізація поживного середовища; підготовка інокуляту та посівного матеріалу; виробничий біосинтез; фільтрація та відмивання міцелію; грануляція та сушка сирої біомаси). Для відбору проб на ферментері встановлено спеціальні пробовідбірники. Для того, щоб при відборі проб до апарату не потрапляла стороння мікрофлора з оточуючого середовища, пробовідбірники оснащені спеціальною арматурою. Перевіряють проби у центральній заводській лабораторії шляхом висіву на МПА та прямим мікроскопіюванням [13].

Для перевірки застосовують „Чашечний метод”. Цей метод знайшов широке застосування для встановлення кількості мікроорганізмів у натуральних та синтетичних субстратах. Вважають, що кожна жива клітина при посіві на щільне поживне середовище утворює колонію. Виконання аналізу включає три етапи: приготування розведень (Метод Коха), посів на щільне поживне середовище у чашках Петрі, підрахунок колоній. При виробництві авермектинів при мікробіологічній перевірці обладнання, приміщень, стерильного поживного середовища, повітря у пробах повинна бути відсутня будь-яка мікрофлора. При перевірці чистоти маточної культури та культуральної рідини під час основної ферментації, у пробах повинні виявлятися лише колонії біологічного агента –Streptomyces avermitilis, в іншому випадку продукція вважається бракованою [13].

Для того, щоб отримати окремі колонії, проби матеріалу, що досліджується, попередньо десятикратно розводять за методом Коха. З цією метою стерильну воду або ж фізіологічний розчин (0,5 %-ий розчин хлориду натрію) розливають по 5 мл у стерильні сухі пробірки. 1 мл вихідної проби асептично вносять у першу пробірку, закривають ватною пробкою, добре перемішують і отримують 1 розведення – 1:10 [13].

Отриману у першому розведенні суспензію за допомогою стерильної піпетки добре перемішують, затягуючи до піпетки і видува з неї суспензію декілька разів. Потім цією ж піпеткою беруть 1 мл розведення і переносять до другої пробірки з 9 мл води – 2 розведення – 1:10². Беруть нову піпетку і так само готують 3 розведення – 1:10³, проводять розведення до 1:10⁸. Два останні розведення висівають на чашки Петрі із МПА, при чому кожне розведення висівають на 3 різні чашки. Посів роблять мікробіологічною петлею над полум’ям пальника. Петлею відбирають розведення, відкривають чашку Петрі над вогнем з одного боку і зигзагом (штрихом) проводять петлею по поверхні середовища. Чашку закривають і ставлять до термостату при 37°С. Також роблять відповідно посіви на середовище що містить агар з 0,5 % глюкозою та густого середовища «Сабуро». Відношення посівної дози до обсягу живильного середовища має становити 1:10 або 1:20 [13].

Посівний матеріал розподіляють по всій поверхні поживного середовища, покачуючи пробірку. Посіви на МПА інкубують при температурі (37±1)°С спочатку в горизонтальному (на протязі 2 діб), а потім у вертикальному положенні. Результати посівів слід враховувати через 48, 72 години і остаточно через 8 діб. Посіви на середовищі Сабуро інкубують при температурі (22±1)°С на протязі 8 діб, спочатку в горизонтальному (на протязі 2 діб), а потім у вертикальному положенні [13].

Після інкубації посівів на протязі зазначених термінів на середовищах МПА, живильному агарі з глюкозою не повинний бути виявлений ріст сторонньої мікрофлори, на густому середовищі "Сабуро" - ріст грибів [13].

Контроль санітарного стану заводу

Контроль санітарного стану заводу є однією із умов, що забезпечує випуск високоякісної продукції [13].

Посторонні мікроорганізми, розмножуються на залишках поживного середовища і в погано вимитому, і не продезінфікованому обладнанні, попадають в готову продукцію, а також можуть розмножуватись в культурі. Вони порушують правильне харчування наших мікроорганізмів – продуцентів, а інколи пригнічують їх ріст. В результаті чого порушується технологічний процес і погіршується якість продукції [13].

Для постійної підтримки високого рівня санітарного стану виробництва необхідний регулярний контроль, який дозволяє виявляти очаги і джерела інфекції і своєчасно їх знищувати, а також регулярно мити та дезінфікувати обладнання і приміщення [13].

Контроль чистоти рук і одягу

Чистоту рук перевіряють перед початком виробничого процесу в робітників, що мають безпосередній контакт із продукцією або чистим устаткуванням. Контроль провидиться без попередження [13].

Закріплений на дерев'яному стрижні стерильний тампон змочують стерильною водою і протирають ним долоні, тильну поверхню рук, під нігтями й між пальцями обох рук. Тампон занурюють у ту саму пробірку, у якій робили змочування, добре збовтують і відбирають 1 см³ та підготовлюють розведення(1:10 та 1:100) [13].

Для визначення загальної кількості мікроорганізмів в 1 см³ змиву роблять посів розведень на мясопептоний агар з наступним термостатуванням при 30 ºС вродовж 48 год. Залишок змиву разом з тампоном висівають у пробірки з 5 см³ середовища Кесслера і вирощують 24 год при температурі 37 ºС. Далі визначають наявність кишкових паличок за методом бродильних проб [13].

Для взяття змивів з спецодягу протирають тампоном чотири площі по 25 см³ з нижньої частини кожного рукава і попередньої частини поверхні спецодягу. Халати, фартухи, рукавички, куртки із тканини періодично просліджуються на наявність кишкових паличок посівом 1 см³ змивної води в середовище Кесслера. Кишкові палички на чистому спецодязі відсутні [13].

В змивах з рук після обробки антисептиками повинні бути відсутні життєздатні мікроорганізми. В процесі роботи допускається наявність не більше 5 колоній життєздатних мікроорганізмів на двох паралельних чашках Петрі в змивах з рук одного працюючого у виробничих приміщеннях [13].

Контроль обладнання

Контроль проводять безпосередньо після миття та дезинфекції перед початком роботи шляхом висіву відібраних змивів для визначення загальної кількості мікроорганізмів в 1 мл. Готують стерильні ватні та марлеві тампони, пробірки з 10 мл стерильної води і стерильні пінцети. Тампони закріплюють на дерев’яних стержнях, кожен окремо занурюють у пробірку з 10 мл води і стерилізують при 0,1 МПа протягом 20-30 хв. Змиви з великого обладнання і апаратів беруть за допомогою нержавіючих металевих трафаретів із вирізаною серединою (площа вирізу 10, 25 – 100 см²). Перед взяттям проби трафарет змочують спиртом, обпалюють та накладають на поверхню, яку досліджують. Площу, яка відкрита, промивають змоченим тампоном, після чого тампон занурюють у ту саму пробірку, занурюють у залишену воду і добре перемішують. Висівають 1 мл змиву на МПА. Визначають загальну кількість мікроорганізмів після термостатування при 37°С протягом 48 год [13].

У змивах стерильного обладнання мікроорганізми відсутні. У добре вимитих апаратах загальна кількість мікроорганізмів і титр кишкової палички не повинні перевищувати їх вміст у чистій воді, що поступає для миття [13].

Технологічний контроль

Технологічний контроль виробництва полягає у постійному визначенні та регуляції основних показників процесів стерилізації, культивування тощо. Такими технологічними показниками є температура, тиск, рН. Ці параметри під час виробництва авермектинів постійно регулюються за допомогою спеціальних автоматизованих пристроїв, які встановлені практично на кожному апараті апаратурної схеми [13].