Розділ 2.2. Обґрунтування вибору технологічної схеми

Для виробництва авермектинів використовується штам Streptomtces avermitilis УКМ Ас – 2177. Культивування проводять глибинним способом у ферментері з подальшим виділенням антибіотиків шляхом центрифугування, руйнування клітинної стінки, екстрагування з наступним центрифугуванням. Розфасовка готової продукції [14].

2.2.1. Порівняльний аналіз біологічних агентів

Значна частина стрептоміцетів є продуцентами біологічно активних речовин, таких як антибіотики, вітаміни, ферменти, імуномодулятори та ін. Стрептоміцети представляють великий інтерес у зв’язку з їх важливим значенням для промислового виготовлення різних антибіотиків та ряду бологічно – активних речовин. Відомо про здатність ґрунтових стрептоміцетів синтезувати клас речовин під назвою авермектини. Найціннішими для промислового використання є авермектини з максимально високим вмістом компоненту В1_а у комплексі [8]. Здатність продукувати авермектиновий комплекс була досліджена у 639 культур мікроорганізмів (досліджувались 431 музейна культура та 208 ізолятів стрептоміцетів, виділених із сірого опідзоленого ґрунту і чорнозему типового малогумусного Київської та Житомирської областей), які належать до 5-ти секцій і 16-ти серій [8]. Особлива увага приділялась представникам секції Cinereus, а саме серії Chromogenes, до якої належить типовий штам-продуцент авермектинів – Streptomyces avermitilis, та близьким до неї серіям Achromogenes i Chrysomallus [8].

З наукової точки зору дослідникам необхідно було з’ясувати також, чи є здатність до авермектиноутворення видовою ознакою [8]. Пошук авермектинсинтезуючих культур здійснювали в три етапи. Метою першого етапу роботи дослідників було за допомогою методу тонкошарової хроматографії (ТШХ) встановити наявність чи відсутність авермектинів або подібних до них речовин серед продуктів метаболізму досліджуваних культур [8]. Результати перевірки показали, що у 16 культур у спиртових екстрактах з міцелію присутні речовини, які, судячи з результатів хроматографії, співпадали з різними компонентами авермектинового комплексу, а у двох – речовини, повністю йому ідентичні. Останні були одержані з культур Streptomyces sp.1312 та Streptomyces sp.1313[8]. Відібрано дві культури (робочі номери 1312 і 1313), які продукують складові авермектинового комплексу А1, А2, В1 і В2 з більш високим вмістом. Аналіз спиртових екстрактів з допомогою рідинної хроматографії показав, що культури 1312 і 1313 синтезують окремі компоненти авермектинів у такому співвідношенні: А1–4,8; А2–85,7; В1–4,8; В2–4,8 (%) [8]. На другому етапі робіт за допомогою колориметричного методу (КМ) з орциновим реактивом визначали концентрацію авермектинів у екстрактах з 16 відібраних культур. Оскільки деякі з цих екстрактів були забарвленими, то визначення в них вмісту авермектинів КМ було неможливим. При перевірці решти екстрактів виявилось, що всі вони, крім двох (1312 та 1313), містили незначну кількість авермектиноподібних речовин (1-10 мкг/см3). Культури 1312 та 1313, за даними КМ, синтезували 30 і 36 мкг/см³ авермектинів, відповідно [8]. На третьому етапі досліджень для остаточного підтвердження здатності цих культур утворювати авермектини використовували метод високоефективної рідинної хроматографії [8].

З 16-ти досліджених авермектинсинтезуючих культур стрептоміцетів три ідентифіковані як S. olivaceoviridis (серія Chrizomallus), вісім – як S. phaeochromogenes (серія Fuscus), дві – як S. chromogenes (серія Cinereus), одна – як S. globosus (серія Chromogenes) та дві культури (робочі номери 530 та 531) не були визначені до виду. На основі культуральних і фізіолого-біохімічних ознак штам Streptomyces sp. 1313 віднесено до виду “avermitilis”. Цей штам зберігається в Колекції культур мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології НАН України під номером УКМ Ас 2161. Результати досліджень щодо визначення патогенних властивостей (вірулентність, токсичність та інвазійність) дозволяють охарактеризувати штам як авірулентний, нетоксичний, нетоксигенний, не здатний до інвазії у внутрішні органи досліджених теплокровних тварин та віднести його за ступенем небезпеки штамів мікроорганізмів до 4-го класу [8]. Після триступеневого відбору були визнані перспективними 16 штамів (табл. 2.2.1.1).

Таблиця 2.2.1.1

Систематичний розподіл досліджених культур стрептоміцетів

Секції	Серії	Кількість культур
		перевірених	авермектинсинтезуючих
Albus	Albus	20	0
	Albocoloratus	34	0
Cinereus	Achromogenes	107	2
	Chromogenes	150	3
	Chrysomallus	102	2
	Aureus	47	0
	Violaceus	37	0
Helvolo-Flavus	Flavus	13	0
	Helvolus	26	0
Roseus	Lavendulae-Roseus	27	0
	Fradiae	7	0
	Fuscus	21	9
	Roseoviolaceus	13	0
	Ruber	10	0
Azureus	Glaucescens	23	0
	Coerulescens	2	0
Всього		369	16

Для подальшого підвищення біосинтетичної активності штаму Streptomyces avermitilis IMV Ac 2161 до конкурентоспроможного рівня було проведено ряд селекційних робіт із застосуванням ефективних мутагенних факторів (фізичних, хімічних, фізико-хімічних, комбінованих). Показано, що моноізоляти під робочими номерами 1317, 1390 і 1392 продукували відповідно 253, 250 та 260 мкг авермектинів, що на 58-62,5 % перевищувало активність вихідного варіанту [8].

Ще однією причиною вибору саме цього біологічного агента є склад поживного середовища. Важливим є застосування легкодоступних і дешевих компонентів природного походження поживного середовища, а також технологічно ефективних і економічно доцільних способів виготовлення. До того ж одним з найсуттєвіших чинників, що впливає на активність продуцента авермектинів, є ферментаційне середовище для вирощування S. avermitilis УКМ Ас – 2177, яке являє собою багатокомпонентну суміш поживних речовин і мікроелементів. Було встановлено, як впливає кожний з компонентів залежно від його кількості і визначено збалансований склад ферментаційного середовища для S. avermitilis УКМ Ас – 2177, при культивуванні на якому його активність була б максимальною [15]. Головним чинником, від якого залежить активність культури-продуцента авермектинів, є співвідношення вуглеводної і азотної складових живильного середовища. Проведені дослідниками експерименти з визначення впливу C/N на активність S. avermitilis УКМ Ас – 2177 при фіксованих значеннях інших складових середовища і незмінних технологічних умовах ведення процесу. Результати наведені на рис. 2.2.1.1. [15]. Результати експериментів показали, що найбільшу продуктивність штам S. avermitilis УКМ Ас – 2177 виявляє на середовищі, до складу якого входять глюкоза, соєве борошно, сухі дріжджі, кукурудзяний екстракт, крейда, К₂НРО₄ та крохмаль, але для промислового застосування деякі компоненти необхідно замінити більш дешевими [15].

Рис. 2.2.1.1. Залежність біосинтетичної активності S. avermitilis УКМ Ас – 2177 від співвідношення C/N і кількості крохмалю в поживному середовищі

Продуктивність даного штаму була недостатньою для використання його у промислових масштабах, що були б економічно вигідними, тому була проведена робота по підвищенню біосинтетичної активності штаму S. avermitilis УКМ Ас-2161, що дала змогу збільшити шляхом спонтанної мінливості та індукованого мутагенезу ультрафіолетовим опроміненням та N-метил-N′-нітро-N-нітрозогуанідином активність природного варіанту S. avermitilis УКМ Ac-2161 в 20 разів [23].