Дослід 2. Дослідження термолабільності амілази слини.

Принцип методу. Метод базується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0,5 % р-н крохмалю, 0,1 розчин І₂ в KІ, 10 % р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, холодна вода (лід), штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У пробірку вносять 2 мл розведеної слини і кип’ятять на відкритому вогні протягом 2 хв. Вміст пробірки охолоджують. В три інші пробірки вносять по 5 мл 0,5 % р-ну крохмалю. В пробірку № 1 додають прокип’ячену слину, а в пробірки № 2 і № 3 по 2 мл розведеної непрокип’яченої слини. Пробірку № 2 ставлять на 10 хв на водяну баню при температурі 37С. Пробірку № 3 поміщають на 10 хв у холодну воду з льодом. Після інкубації вміст кожної пробірки розділяють порівну. До відібраних проб додають по 3-5 крапель р-ну І₂ в KІ і спостерігають за зміною забарвлення. З пробами, що залишилися проводять реакцію Тромера (див. дослід № 1).

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 3. Вивчення специфічності дії амілази слини та сахарази дріжджів.

Принцип методу. Специфічність дії є однією з найбільш характерних властивостей ферментів і полягає в тому, що кожен фермент діє на певний субстрат чи групу субстратів, які мають подібну структуру. Розрізняють абсолютну, відносну (групову) та стереохімічну специфічність. Висока специфічність ферментів обумовлена їх білковою природою та структурою активного центру.

Амілаза слини розщеплює крохмаль до дисахариду – мальтози і не діє на дисахарид – сахарозу, сахараза розщеплює сахарозу на глюкозу та фруктозу і не каталізує розщеплення крохмалю. Ступінь гідролізу субстратів оцінюють за результатами реакції Тромера. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому утворює забарвлену сполуку з реактивом Тромера, а сахароза не містить вільної альдегідної групи, тому реакція негативна.

Матеріальне забезпечення: 1 % р-н крохмалю, препарат сахарази дріжджів, 1 %-го розчин сахарози, 0,1 % розчин І₂ в KІ, 10 % р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи.

Специфічність амілази: в пробірки № 1 і 2 поміщають по 1 мл розведеної в два рази слини. В пробірку № 1 додають 2 мл 1 %-го розчину крохмалю, в пробірку № 2 – 2 мл 1 %-го розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять в термостат при t = 37C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Тромера.

Специфічність сахарази дріжджів: в пробірки № 3 і 4 поміщають по 1 мл препарату сахарази дріжджів. В пробірку № 3 додають 2 мл 1 %-го розчину сахарози, в пробірку № 4 – 2 мл 1 %-го розчину крохмалю. Обидві пробірки ставлять в термостат при t = 37C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Тромера.

Результати проведеного експерименту заносять в таблицю:

№ пробірки	Фермент	Субстрат	Реакція Тромера
1	Амілаза	Крохмаль
2	Амілаза	Сахароза
3	Сахараза	Сахароза
4	Сахараза	Крохмаль

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Амілаза синтезується переважно в слинних та підшлунковій залозах. Підвищення активності амілази в крові спостерігається при панкреатиті, перитоніті, тромбозі судин, внаслідок введення в організм ряду фізіологічно активних сполук, зокрема морфіну, кодеїну, кортикотропіну (АКТГ) та кортизолу.

Підвищення активності амілази слинних залоз спостерігається при стоматиті, невралгії лицевого нерва, нирковій недостатності, паркінсонізмі. Зниження активності амілази крові спостерігається при психічних захворюваннях, анацидних порушеннях. Зниження вмісту амілази в слині має місце при гіпосалівації, запаленні слинних залоз, тощо.

Дослід 4. Дослідження впливу рН середовища на активність амілази слини.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення за умов оптимального для амілази рН середовища. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0,5 % р-н крохмалю, 0,1 % розчин I₂ в KI, 10% р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У три пробірки вносять по 2 мл 0,5 %-го р-ну крохмалю. У першу додають 2 мл фосфатного буферу рН 5,0, у другу – рН 7, а в третю – рН 9. В кожну з пробірок вносять по 1 мл розведеної слини і поміщають їх у водяну баню на 15 хв при температурі 37^°С.

Після інкубації вміст кожної пробірки ділять порівну. До перших фракцій додають по 3-5 краплі р-ну І₂ в KI і спостерігають за зміною забарвлення. З фракціями, що залишилися проводять пробу Тромера (див. дослід № 1).

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.