Практична робота
Дослід 1. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ) уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля.
Принцип методу. У результаті реакції трансамінування під дією АлАТ утворюються піруват і глутамат. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється гідразон піровиноградної кислоти червоно-бурого забарвлення, інтенсивність якого прямопропорційна кількості утвореної піровиноградної кислоти і є показником активності АлАТ.
Матеріальне забезпечення: 0,4 М розчин NаОН, субстратний розчин (29,2 мг б-кетоглутарової кислоти і 1,78 мг D,L-аланіну розчиняють в 1 М NаОН до отримання рН 7,4, розчин переливають у мірну колбу на 100 мл і доводять 0,1 М фосфатним буфером до мітки). 0,1% розчин 2,4-динітрофенілгідразину, фотоелектроколориметр, термостат або водяна баня, холодильник, штатив з пробірками, піпетки.
Хід роботи.
А) Кількісне визначення піровиноградної кислоти:
У дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл свіжорозмороженого субстратного розчину і ставлять у термостат при температурі 370С на 5 хв. Потім у дослідну пробірку додають 0,1 мл досліджуваної сироватки, а в контрольну – 0,1 мл води і обидві пробірки ставлять в термостат при 370С на 30 хв. Після інкубації пробірки виймають та в обидві додають по 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину, перемішують і витримують 20 хв при кімнатній температурі. Потім додають в обидві пробірки по 5 мл 0,4 М NaOН, перемішують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі при зеленому світлофільтрі (λ = 500-560 нм) у кюветі з товщиною шару 10 мм проти контрольної проби.
Кількість утвореної піровиноградної кислоти (у мкг) знаходять за калібрувальним графіком або за формулою (І):
Х = 10 × А (I),
де: А – визначена оптична густина.
В) Активність АлАТ вираховують за формулою (ІІ):
де: Х – кількість піровиноградної кислоти, знайденої за калібрувальним графіком або за формулою І, мкг;
2 – коефіцієнт перерахунку на 1 год інкубації;
10 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки;
88 – маса 1 мкмоль піровиноградної кислоти.
Зробити висновок.
Клініко-діагностичне значення. Трансамінази є внутрішньоклітинними ферментами. Зростання їх концентрації в крові свідчить про синдром цитолізу – порушення цілісності клітин. У цитоплазмі клітин концентрація АлАТ переважає над концентрацією АсАТ, але в мітохондріях є специфічна ізоформа АсАТ . Тому при захворюваннях запального типу (порушення проникності клітинних мембран) у сироватці крові в більшій мірі зростає активність АлАТ, а при захворюваннях некротичного типу (руйнування не тільки клітин, але й органел, зокрема, мітохондрій) переважає активність АсАТ.
Активність АсАТ у крові зростає через 4-6 год. після інфаркту міокарда і звичайно повертається до норми на 3-7 день. При стенокардії АсАТ залишається в нормі.
Найвища активність АлАТ характерна для захворювань печінки – особливо в інкубаційному періоді інфекційного гепатиту.
Зниження нормальних показників амінотрансфераз у плазмі може бути при недостатності вітаміну В6, а також при нирковій недостатності.
Діагностично важливим є одночасне визначення активності АлАТ і АсАТ та розрахунок коефіцієнта де Рітіса – АсАТ/АлАТ, який в нормі дорівнює приблизно 1,3. При інфекційному гепатиті він нижчий норми, при інфаркті міокарда – вищий норми.
Нормативні величини: для АлАТ – 28-190 нмоль/(с·л), 0,1-0,68 мкмоль/(год.мл) при 37 оС або 11,4 МО/л.
Дослід 2. Уніфікований метод визначення креатиніну за кольоровою реакцією Яффе (метод Поппера і співавторів)