Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення активності амілази сечі (діастази) за методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 %-го розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості мл 0,1 %-го розчину крохмалю, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл нерозведеної сечі при температурі 45^оС протягом 15 хв.

Матеріальне забезпечення: сеча, 0,1 % р-н крохмалю, 0,1 % розчин I₂ в 0,2 % розчині KI, 0,85 % р-н NaCl, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У дев’ять пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл 0,85 % р-н NaCl. У першу пробірку додають 1 мл сечі. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї – в третю, таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менше, ніж у попередній. З останньої пробірки 1 мл суміші виливають для зрівняння об’єму. Потім в усі пробірки додають ще по 1 мл 0,85% р-н NaCl та по 2 мл 0,1%-го розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 45С на 15 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1%-ний розчин йоду в 0,2 %-му розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина в пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності в сечі:

Показник	№ пробірки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Розведення сечі (в кількість разів)	2	4	8	16	32	64	128	256	512
Кількість 0,1 %-го розчину крохмалю, мл	2	2	2	2	2	2	2	2	2
Забарвлення після додавання йоду	Ж	?	?	?	?	?	?	?	С
Остання пробірка з розчином жовтого кольору

Приклад розрахунку активності амілази в сечі: остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в ній сеча розведена у 16 разів. Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/16 Мл сечі розщеплює 2 мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1Мл сечі розщеплює - х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки X = ^{1 × 2_} = ^{2 × 16} = 32 мл

^{1/16 1}

отже: Х (амілазна активність) = 32 умовних одиниці.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності в крові та сечі. У нормі активність амілази сечі коливається в межах 16-64 одиниць. При гострих панкреатитах активність амілази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо протягом першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми.

Дослід 2. Кількісне визначення активності пептидаз панкреатину.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності пептидаз гідролізувати пептидні зв’язки, що приводить до зростання кількості вільних аміно- та карбоксильних груп. Після блокування аміногруп формаліном, карбоксильні групи підвищують кислотність середовища, приріст якого визначається титруванням лугом за методом Зернсена в присутності індикатора фенолфталеїну.

Матеріальне забезпечення: 6 % розчин казеїну, фосфатний буфер рН 7,6, панкреатин, фенолфталеїн, 0,2 н розчин NaОН, 0,02н розчин NaОН, формольна суміш рН 8,3, штатив з пробірками, піпетки, колбочки для титрування, бюретка, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. У дві пробірки відмірюють по 5 мл 6 % розчину казеїну і по 2 мл фосфатного буферу рН 7,6. В одну з пробірок додають 0,5 г панкреатину, старанно перемішують і ставлять у водяну баню при температурі 37⁰С разом з контрольною пробіркою.

Через 30 хв пробірки знімають з бані, охолоджують, їх вміст переливають у колбочки для титрування, додають в кожну по 2-3 краплі фенолфталеїну і підлужнюють з піпетки 0,2 н розчином NaОН до утворення блідорожевого забарвлення (рН-8,3).

При такому рН кількість аміногруп у розчині дорівнює кількості карбоксильних груп. Далі в обидві колбочки додають по 5 мл формольної суміші (рН-8,3). Формалін зв’язує аміногрупи, а карбоксильні групи зсувають рН розчину в кислу сторону. Розчин знебарвлюється. Обидві проби титрують із бюретки 0,02 н розчином NaOH до утворення слабо-рожевого забарвлення (рН 8,3) і додають ще декілька крапель 0,02 н розчину NаОН до яскраво червоного кольору (рН 9,1).

Вираховують різницю між даними титрування досліджуваного і контрольного розчинів. Активність пептидаз виражають в умовних одиницях. Одна умовна одиниця відповідає 1 мл 0,02 н розчину NаОН, затраченого додатково на титрування дослідної проби.

Приклад розрахунку:

Кількість 0,02 н NаОН, що пішла на титрування гідролізату казеїну ............. мл.

Кількість 0,02 н NаОН, що пішла на титрування контрольного розчину ...…. мл.

Різниця у кількості 0,02 н NaOH між дослідним і контр. розчином ................. мл.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У нормі активність пептидаз сироватки крові становить 0,2-1,7мкмоль/мл год. Збільшення вмісту пептидаз у сироватці крові та зростання їх активності спостерігається при гострому панкреатиті, виразковій хворобі, обширних опіках, гострому гепатиті. Зниження активності пептидаз може спостерігатися при емфіземі легень, цирозі печінки.