Исследование на наличие гельминтов проб почвы, воды, травы и навоза

Исследование проб почвы. С целью определения загрязненности яйцами и личинками гельминтов почвы ее берут около помещений, на пастбищах, прогонах и в других местах на глубине до 15—20 см. С каждого участка через каждые 10 м берут около 50 г почвы, перемешивают ее и со средней пробы отбирают 100 г почвы.

А. И. Корчагин (1984) с целью выявления в почве или в соскобах с твердых покрытий животноводческих помещений яиц аскаридат или стронгилят предлагает из отобранных образцов брать по 15—25 г почвы, а в качестве флотационной жидкости применять раствор нитрата аммония плотностью 1,3 или нитрата натрия плотностью 1,38. Пробу почвы помещают в центрифужную пробирку емкостью 250 мл, добавляют 100 мл 3%-ного раствора едкого натрия, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 3—5 минут со скоростью 1000 об/мин. После этого надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 150 мл воды, опять хорошо перемешивают и повторно центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 150 мл раствора нитрата аммония, перемешивают и фильтруют через капроновое или металлическое ситечко с размерами ячеек 0,5х0,5 мм в другую пробирку и опять центрифугируют. После этого пробирки со смесью ставят в штатив и в каждую из них доливают раствор нитрата аммония до уровня ниже края пробирки на 2—4 мм. После этого берут предметные стекла размером 6х6 см, покрывают ими пробирки, в которые пипеткой добавляют раствор нитрата аммония до соприкосновения его с нижней поверхностью стекла. Через полчаса стекла снимают и подсчитывают количество яиц гельминтов в пробе.

При исследовании соскобов пробу берут в количестве 15—25 г с разных мест пола, нижних участков стен, перегородок через каждые 5 м. Для исследования соскобов применяют те же флотационные растворы и аналогичные подходы, что и при исследовании почвы.

Для выявления в почве личинок нематод применяют метод Бермана. С этой целью 30—40 г почвы помещают на молочные фильтры в воронки аппарата Бермана, заполняют теплой водой (40 °С). Через 3—4 ч содержимое переливают в пробирки, центрифугируют 1—2 минуты со скоростью 1000 об/мин, верхний слой жидкости в пробирках сливают, а осадок микроскопируют.

Исследование проб навоза на наличие яиц и личинок гельминтов проводят теми же методами, что и исследование почвы, но при исследовании навоза на наличие яиц гельминтов пробы фильтруют через металлические ситечки, чтобы крупные частицы не мешали при микроскопировании поверхностной пленки.

Жидкие и плотные фракции навоза на наличие яиц гельминтов исследуют по модифицированному методу А. А. Черепанова (1972). Из плотной фракции отбирают 100 г навоза, из жидкой фракции — 0,5 кг. Пробу плотной фракции навоза смешивают с небольшим количеством воды, растирают в ступке и фильтруют через марлю под напором струи воды из водопровода. Фильтрат помещают в пробирки и центрифугируют 3 мин со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, а к осадку добавляют раствор нитрата натрия или аммиачной селитры и повторно центрифугируют. После этого в пробирки наливают доверху флотационный раствор, покрывают предметными стеклами и через 20-25 минут их микроскопируют. После фильтрации жидкую фракцию навоза исследуют аналогичным образом.

Методика Н. А. Акулина для исследования травы на выявление личинок стронгилят. Перед началом исследований готовят оборудование: тазы диаметром 36 см и высотой 15 см; стеклянные воронки диаметром 20 см, к которым прикрепляются пробирки с помощью резиновых трубок; штатив для воронок; микроскопы; сита диаметром 31 см с высотой боковой стенки 12 см, размер ячеек сетки сита 1 мм; глазные пипетки, предметные стекла, раствор Люголя.

Отбирают пробы травы по 100—120 г и помещают их в сито. Его ставят в таз с теплой водой (22—24 °С). Между сеткой сита и дном таза должно оставаться расстояние в 5—7 см. Через 24 ч сито с травой вынимают из таза, а через полчаса воду из таза осторожно сливают, оставляя осадок в количестве примерно 1,5 л. После этого в штатив вставляют воронки с прикрепленными к ним пробирками и в воронки выливают осадок из таза, перед этим хорошо перемешав его. Через 2 ч пробирки от воронок отделяют и осадок в них исследуют с помощью микроскопа. При необходимости обездвиживания личинок применяют раствор Люголя, добавляя одну каплю его к капле исследуемой на предметном стекле жидкости. В пастбищный сезон для выявления личинок диктиокаул траву рекомендуется исследовать один раз в неделю, а для обнаружения стронгилят желудка и кишечника жвачных — через каждые две недели.

Исследование воды для обнаружения яиц и личинок гельминтов. При исследовании воды крупных водоемов в различных местах берут пробы в объемах от 0,5 до 10 л. С поверхности воды пробы берут малыми емкостями — 0,5-1 л через каждые 3-5 минут, чтобы через час средняя проба составила 10 л. Из колодцев, водопровода проба воды должна быть не менее 25 л. Целесообразно пробы воды брать в различные сроки дня и в различные периоды года для установления динамики загрязненности ее личинками и яйцами гельминтов.

Метод исследования воды по 3. Г. Васильковой (1955). Отбирают пробу воды и фильтруют ее через крупнопористые фильтры (диаметр пор 3—5 мкм). При этом задерживаются яйца и личинки гельминтов. В ветеринарной лаборатории воду можно фильтровать через воронку Гольдмана с применением насоса Комовского. В полевых условиях применяют ручной насос, при этом за 1 ч фильтруют 10 л воды, используя 10—20 фильтров. После этого фильтры помещают на большие предметные стекла и микроскопируют.

Для фильтрации можно применять также бумажные фильтры для исследования речной и сточной воды. При этом за 1 ч удается исследовать 2—3 л воды с применением около 50 фильтров.

Если нет фильтров, воронок Гольдмана и другого оборудования, в полевых условиях воду просто отстаивают в 10-литровой посуде, осадок сливают в пробирки, центрифугируют и исследуют.

Все описанные выше методы исследований почвы, навоза, воды и травы могут быть применены при гельминтологической оценке пастбищ при многих геогельминтозах.

Обследование пастбищ и водоемов при биогельминтозах

Заражение животных на пастбищах, в местах прогона и из водоемов биогельминтами зависит исключительно от наличия там промежуточных хозяев, а также степени их зараженности гельминтами.

В европейской части нашей страны промежуточным хозяином для фасциол служит пресноводный моллюск Galba truncatula (L. truncatula) — малый, или усеченный, прудовик. При влажности ниже 45 % малые прудовики погибают (В. В. Горохов, 1973). Биотопы малого прудовика отличаются большим разнообразием — это небольшие лужи, мочажины, неглубокие болота, пруды и т. д. Плотность его на 1 м² колеблется от единичных экземпляров до нескольких сотен. Биотопы малого прудовика могут быть постоянными или временными. Малый прудовик предпочитает поселяться на богатых гумусом почвах, хорошо освещенных солнцем. Как правило, его нет в водоемах на глубине более 20 см или он там встречается редко.

Малый прудовик откладывает яйца на остатках растительности, на кусках дерева, на камнях или просто на влажной почве, даже в самой воде. В каждой кладке одного моллюкса содержится от 4 до 30 яиц. Подсчитано, что за 16 дней один такой моллюск может отложить до 400 яиц (S. В. Кеndall, 1953). Молодые особи выходят из яиц через 10-32 дня после их откладки (в зависимости от температуры и влажности), а половозрелыми моллюски малого прудовика становятся через 21-63 дня после вылупления из яиц. При благоприятных условиях уже во второй генерации потомство одного моллюска малого прудовика может достичь 160 тыс. экземпляров (Е. Е. Шумакович, 1973). В условиях Беларуси и Нечерноземной зоны России яйцекладка малого прудовика может проходить с мая по сентябрь, в течение этого времени каждый моллюск откладывает яйца 2-3 раза. Считают, что срок жизни малого прудовика от года до 4 лет.

На наличие моллюсков малого прудовика осматривают прибрежную часть водоемов, берега, растительность, дно у берега водоемов на глубину до 20 см. Определяют плотность популяции из расчета на 1 м². Обследование пастбищ проводят в теплое время года при температуре не ниже 20 °С. Особое внимание необходимо уделять низменным местам, заросшим травой. Отобранных в биотопах моллюсков определяют до вида.

Исследование некоторых промежуточных и резервуарных хозяев на наличие гельминтов

Моллюски могут принимать участие в развитии трематод, некоторых цестод и нематод. Для исследования моллюска освобождают от раковины, помещают в чашки Петри, расчленяют на отдельные части и микроскопируют с помощью компрессория. Малых прудовиков, планорбид и других мелких моллюсков исследуют, не снимая раковин. При микроскопии в поле зрения можно найти тре-матод в различных стадиях развития — спороцисты, редии, церкарии, метацеркариев.

Для исследования малого прудовика — промежуточного хозяина фасциолы обыкновенной из каждого биотопа берут не менее 100 экземпляров. Для более точного определения степени инвазированности моллюсков гельминтами исследуют из каждого биотопа 300-400 экземпляров. Этот моллюск имеет коническую тонкостенную раковину серовато-желтого цвета с 5-6 выпуклыми оборотами. Устье моллюска яйцевидное, высота раковины—до 10 мм. Моллюска исследуют полностью или отрезают верхушку раковины, где расположена печень с развивающимися в ней личинками: спороцистами, редиями и церкариями.

Спороциста — первая стадия партеногенетического развития трематод. Образуется она чаще в печени моллюска из проникшего в него мирацидия. Спороцисты трематод бывают различны по форме, у фасциол они веретенообразной формы с закругленными концами. Стенки их тонкие, пищеварительной системы нет, внутри они заполнены клетками. При оптимальных условиях развития внутри спороцисты уже на 8-й день появляются редии. Спороцисты без редий обнаружить трудно, так как они небольшие по размеру (0,1—0,2 мм) и неподвижны.

Редия является второй стадией партеногенетического поколения трематод. После созревания в спороцисте редии разрывают ее оболочку и находятся в основном в печени. Форма тела у редий сигарообразная. Они имеют ротовое отверстие, глотку, кишечник, а также выделительную систему. Сформировавшиеся молодые редии фасциол имеют длину до 0,47 мм, 13-дневные—0,63мм, 19-дневные—до 1,5мм. Внутри молодых редий находятся зародышевые клетки, из которых затем вырастают или дочерние редии, или церкарии. При благоприятных погодных условиях церкарии могут обнаруживаться уже в 24-дневных редиях. Молодых редий фасциол, как и спороцист, нельзя дифференцировать от редий других трематод.

Церкарии после созревания выходят из редий через «родильное отверстие». В зрелом возрасте церкарии фасциолы обыкновенной молочного цвета. Он состоит из двух обособленных отделов —переднего (овального) и заднего — хвостового придатка. Тело церкария размером 0,22—0,35х0,17—0,22 мм имеет ротовую и брюшную присоски, глотку, кишечник и цистогенные железы. Длина хвоста церкария 0,25—0,55 мм. После пребывания в воде 30—40 минут хвосты у церкариев отпадают и они превращаются в адолескариев. Несмотря на то, что отдельные виды трематод развиваются только в моллюсках определенных видов, многие моллюски являются промежуточными хозяевами одновременно для ряда трематод. В связи с этим в них могут быть обнаружены разные церкарии, которых необходимо отличать друг от друга по характерным морфологическим признакам.

Исследование катушек планорбид проводится с целью обнаружения в них личинок парамфистоматид. Установлено, что в хозяйствах Беларуси промежуточными хозяевами парамфистоматид являются моллюски Р1аnоrbis planorbis, Аnisus vоrtех и др. Они находятся в мелиоративных каналах, в небольших водоемах, богатых травянистой растительностью с дерново-глеевыми и пе-регнойно-иловато-глеевыми почвами (рН 5,2—5,5). Плотность их составляет от единичных экземпляров до 75 (и более) на 1 м² поверхности биотопа.

Катушек исследуют с помощью компрессория. При этом личинок парамфистоматид можно обнаружить как в самом моллюске, так и в жидкости, вытекающей при раздавливании их между стеклами компрессория. С апреля до первой половины июля обычно проводят исследование взрослых перезимовавших моллюсков, так как в молодых моллюсках церкариев парамфистоматид можно обнаружить лишь с середины июля до октября. Из одного биотопа вскрывают и исследуют не менее 100—200 моллюсков. В катушках можно обнаружить церкарии различных трематод, поэтому церкариев парамфистоматид необходимо уметь отличать от остальных гельминтов.

Церкарии парамфистоматид темно-коричневого цвета, тело овальной формы, сплющенное, размером 0,21-0,45х0,17-0,30 мм. Передний конец тела оттянут и притуплен, задний более широкий и закруглен. На переднем конце личинки располагается фаринкс, по бокам основания которого находятся два черных глазка треугольной формы. В месте прикрепления к телу хвоста располагается брюшная присоска круглой формы. Длина хвоста составляет 0,59—0,75 мм.

Наземные моллюски исследуются с целью обнаружения в них личинок дикроцелий, эуритрем, протостронгилид и др. На территории европейской части России промежуточными хозяевами для дикроцелий (D. lаnсеаtum) являются следующие виды моллюсков семейства Неlicidае: Неliсеlla саndicans, Неlicopsis instabilis, Monacha cartusiana, Моnасhа truticicola, Рsеudotrichia rubidinosa, Enomphalia strigella и др., а также некоторые моллюски семейств Вгаgуbаеnidае, Сосhlicopidaе, Zonitidae, Gimacidaе, Еnidае и др.

Инвазированность мелких моллюсков личинками дикроцелиев определяют при раздавливании их между стеклами и микроскопированием препаратов. Крупных моллюсков исследуют после освобождения их от раковин и извлечения пищеварительной железы. Последнюю помещают в каплю воды на предметное стекло, измельчают и микроскопируют. При этом необходимо обнаружить материнские и дочерние спороцисты или церкарии. Последние представляют собой овально-удлиненной формы личинку с длинным хвостом. Зрелых церкариев обнаруживают в моллюсках чаще в весенне-летний период.

В моллюсках церкарии проникают в их дыхательную полость, покрываются клейким слизистым веществом, образуя слизистые комочки, в которых содержится до 200 церкариев и более. Из тела моллюска слизистые комочки выталкиваются и прилипают к растениям.

Муравьи находят слизистые комочки с церкариями дикроцелий и охотно их поедают. В теле муравья церкарии мигрируют в его брюшную полость, покрываются цистой и превращаются в метацеркариев. Для заражения животных дикроцелиями необходимо, чтобы муравьи с метацеркариями этих гельминтов попали в организм. В связи с этим для гельминтологической оценки пастбищ на дикроцелиоз необходимо провести исследование муравьев. Для этого отыскивают и устанавливают зараженность не всех собранных муравьев, а только тех, которые находятся в состоянии «оцепенения». Насекомых помещают в пробирку и на 3-5 минут кладут туда ватный тампон, смоченный эфиром. Затем на предметном стекле препаровальными иглами у муравьев вскрывают брюшко и просматривают под микроскопом или лупой на наличие метацеркариев. Они бывают видны заключенными в цисту длиной 0,28—0,4 и шириной 0,2—0,26 мм. В одном муравье может находиться от единичных до 350 метацеркариев и более.

Исследования панцирных клещей из родов Schelozibates, Zygoribatula, Сеrаtozetеs и др. проводятся с целью обнаружения личинок мониезий и других цестод из семейства Акантоцефалид. Для этого берут поверхностный слой почвы и с помощью аппарата Тульгрена выделяют орибатид. Клеща помещают на предметное стекло в каплю воды, панцирь его расщепляют иглами, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоид мониезий представляет собой шаровидное образование диаметром 0,16—0,20 мм, в центре которого находится сколекс с присосками.

Обследование объектов внешней среды для обнаружения клещей и паразитических насекомых

Обследование пастбищ для обнаружения иксодовых клещей. На деревянный стержень длиной 100 см прикрепляют кусок марли или ткани размером 60х80 см и медленно обеими сторонами проводят по траве или мелкому кустарнику обследуемого пастбища. После этого марлю или ткань осматривают и собирают клещей.

Для сбора иксодовых клещей можно пользоваться также специальным экраном, представляющим собой легкую деревянную раму размером 180-200х80-100 см. С одной стороны раму затягивают белой бязью, разграфленной на восемь - десять поперечных полос на равном расстоянии одна от другой. Один человек проносит экран в вертикальном положении через заросли, второй наблюдает за экраном и снимает прикрепившихся к нему клещей, которых затем исследуют или консервируют.

Исследование иксодовых клещей на наличие пироплазматид проводят по методу А. А. Цапруна и А. А. Маркова. Отбирают самок клещей, умерщвляют их хлороформом или эфиром, затем проводят через 96°-ный этиловый спирт. В чашку Петри, дно которой покрыто парафином, наливают физиологический раствор и переносят туда клещей. С помощью ножниц отсекают задний край брюшка клеща, а затем разрезают наружные края брюшка. После этого клеща прикрепляют к парафину тонкими булавками, препаровальной иглой приподнимают задний край его хитиновой покрышки, пинцетом отводят ее вперед и отсекают ее у основания хоботка.

По бокам передней части тела клеща располагаются слюнные железы, их отделяют от трахей, жирового тела и органа Жанэ, помещают на обезжиренное предметное стекло в каплю воды и размельчают препаровальной иглой до получения мелкой суспензии. Из нее готовят тонкий мазок, тщательно его высушивают (в термостате при 37 °С в течение 3 ч, при комнатной температуре — 12ч) и фиксируют метиловым спиртом 10 минут. Окраску мазков проводят по Романовскому-Гимза или по Нохту.

При микроскопировании препаратов пироплазматид находят в виде образований овальной, округлой, грушевидной или червеобразной формы, в которых хорошо видны ядро и протоплазма.

Исследование гемолимфы иксодовых клещей для обнаружения пироплазматид проводят по методу И. В. Абрамова. Для этого самку клеща обмывают дистиллированной водой и высушивают фильтровальной бумагой. Затем ножницами отрезают одну конечность. При этом выступает капелька гемолимфы, которую наносят на обезжиренное предметное стекло и делают мазок. Его высушивают, фиксируют 10 минут метиловым спиртом, красят по Романовскому-Гимза и микроскопируют с использованием иммерсионной системы.

Методы обнаружения аргасовых и гамазовых клещей. Для обнаружения аргасовых и гамазовых клещей в птичниках собирают остатки сухого корма, пыль из трещин в банки с притертыми пробками. После этого небольшими порциями собранный материал помещают на чашку Петри и подогревают на спиртовке. Выползших клещей собирают влажной кисточкой и микроскопируют.

Для обнаружения клещей можно применять и метод флотации. С этой целью небольшое количество сора из птичника или из гнезда (5—10 г) помещают в стеклянный цилиндр емкостью 200 мл, заливают водой, тщательно перемешивают и отстаивают. С поверхности удаляют всплывшие посторонние частицы, воду осторожно сливают, а осадок помещают в пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин 1—2 минуты. Жидкость из пробирки сливают, а осадок микроскопируют.

Сбор орибатидных клещей. Применение аппарата Тульгрена для сбора орибатидных клещей. Вначале собирают аппарат Тульгрена. Для этого берут крупную стеклянную воронку, к узкому концу которой с помощью резиновой трубки прикрепляют пробирку. Раструб воронки затягивают марлей или покрывают металлической сеткой с мелкими отверстиями.

На марлю или сетку помещают исследуемый материал (пробу травы, почвы, мха и др.). Аппарат укрепляют в штативе и на расстоянии 20—25 см от пробы материала помещают электролампу мощностью 100 Вт, постоянно освещающую пробу. В результате подсыхания и под действием света орибатидные клещи выползают из исследуемой пробы, проваливаются через отверстия марли или сетки и попадают в пробирку. Через 1—2 суток пробирку снимают, а клещей помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Метод С. Н. Никольского. Почву или дерн размером 10х10х2 см после тщательного измельчения просеивают через ряд сит. Наиболее мелкую часть отсева насыпают тонким слоем в часовые стекла, которые перед этим ставят в наполненные водой чашки Петри и в таком виде выставляют на хорошо освещенные подоконники. Под влиянием света орибатидные клещи выползают на край часовых стекол и сваливаются в воду, из которой их извлекают акварельными кисточками, помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Сбор паразитических насекомых в помещениях и на пастбищах. Мух-жигалок вылавливают с помощью пробирок, энтомологических сачков или мухоловок. В помещениях они встречаются на протяжении всего лета, но больше всего в августе и сентябре.

Мухи других видов чаще встречаются в летнее время возле животноводческих помещений, навозохранилищ, мусорных ям и т. д. Они предпочитают теплые и освещенные поверхности. После отлова мух умерщвляют в морилке, накалывают на энтомологические булавки или же помещают в склянки с притертой пробкой, куда перед этим наливают 70°-ный этиловый спирт.

Комаров в помещениях отлавливают в различных затемненных местах, а также на окнах, стенах, потолках. Зимой их можно обнаружить в теплых подвалах, погребах, животноводческих помещениях. Их отлавливают с помощью пробирки, после чего помещают в нее ватный тампон, смоченный хлороформом или эфиром.

На пастбищах насекомых отлавливают с помощью энтомологического сачка, который представляет собой мешок длиной 75—100 см, натянутый на обод диаметром 30—35 см и укрепленный на деревянную палку длиной 1,2—1,5 м. Мешок обычно делают из марли.

Энтомологическим сачком кроме мух и комаров отлавливают также слепней. Их обычно находят в местах, заросших кустарником или тростником, возле водоемов, на опушках леса. Отлов их производят также возле животноводческих помещений или летних лагерей для животных.

Следует учитывать, что лет слепней наблюдается с конца мая до августа — сентября при температуре воздуха более 15°С. Особенно интенсивным лет слепней бывает в жаркие и безветренные дни. Умерщвленных в морилке слепней помещают в бумажные коробочки и в дальнейшем высушивают. Применять для консервации слепней спирт, эфир, хлороформ или другие жидкости не следует, так как потом невозможно определить их вид.

Оводов подкожных и желудочных также можно отлавливать с июня до сентября энтомологическим сачком в теплые безветренные дни, когда температура достигает 16—18°С и более. Полостных оводов овец собирают утром руками с помощью ловчего цилиндра или пробирками на стенах животноводческих помещений, на ограде или скирдах сена в безветренную солнечную погоду.

Личинок полостных оводов различных стадий развития можно извлечь из носовой полости животного с помощью различных лекарственных веществ. Для этой цели можно применять также марлевые тампоны, пропитанные смесью лизола и глицерина (1:50). Тампоны прикрепляют к эластичному пищеводному зонду и вводят в глубь носовой полости, проводя легкие продольные и круговые движения им. Некоторые личинки на тампоне оседают и их извлекают из носовой полости животного.