Кишкун А.А
.pdf
652 ■ Глава 10
Метафазные пластинки отдельных клеток фотографируют. Из фотографий вырезают индивидуальные хромосомы и наклеивают их по порядку на лист бумаги; такая картина хромосом называется кариотипом.
Применение дополнительного окрашивания, а также новые методы получения хромосомных препаратов, позволяющих растягивать хромосомы
вдлину, значительно увеличивают точность цитогенетической диагностики. Для описания кариотипа человека разработана специальная номенкла-
тура. Нормальный кариотип мужчины и женщины обозначают как 46, ХY и 46, ХХ соответственно. При синдроме Дауна, характеризующемся наличием дополнительной хромосомы 21 (трисомия 21), кариотип женщины описывают как 47, ХХ 21+, а мужчины — 47, ХY, 21+. При наличии структурной аномалии хромосомы необходимо указать изменённое длинное или короткое плечо: буквой p обозначают короткое плечо, q — длинное плечо, t — транслокацию. Так, при делеции короткого плеча хромосомы 5 (синдром «кошачьего крика») женский кариотип описывают как 46, ХХ, 5p−. Мать ребёнка с транслокационным синдромом Дауна — носительница сбалансированной транслокации 14/21 имеет кариотип 45, ХХ, t(14q; 21q). Транслокационная хромосома образуется при слиянии длинных плеч хромосомы 14 и 21, короткие плечи при этом теряются.
Каждое плечо разделяется на районы, а они в свою очередь — на сегменты, и те и другие обозначают арабскими цифрами. Центромера хромосомы является исходным пунктом для отсчёта районов и сегментов.
Таким образом, для топографии хромосом используют четыре метки: номер хромосомы, символ плеча, номер района и номер сегмента в пределах данного района. Например, запись 6p21.3 означает, что речь идёт о хромосоме 6-й пары, её коротком плече, районе 21, сегменте 3. Существуют ещё дополнительные символы, в частности pter — конец короткого плеча, qter — конец длинного плеча.
Цитогенетический метод исследования позволяет обнаружить делеции и другие изменения в хромосомах только размером приблизительно в 1 млн оснований (нуклеотидов).
Биохимические и гормональные методы
Биохимические и гормональные методы исследования позволяют выявлять основные нарушения обмена веществ и синтеза различных гормонов, ассоциированные с наследственными заболеваниями.
Заболевания, в основе которых лежит нарушение обмена веществ, составляют значительную часть наследственной патологии (фенилкетонурия, галактоземия, алкаптонурия и др.). Все они, вследствие генетического дефекта синтеза определённого фермента, приводят к накоплению в крови больного промежуточных продуктов метаболизма. Биохимические методы исследований легко позволяют определить содержание этих метаболитов
ворганизме и тем самым заподозрить наследственную патологию. Клиническая генетика использует генетический полиморфизм ряда фер-
ментов. Известно, что существуют различные формы одного и того же фермента, катализирующие одну же реакцию, но отличающиеся по своему молекулярному строению. Подобные формы получили название изоферментов. Обнаружение нескольких изоферментов одного и того же фермента свидетельствует о существовании нескольких аллелей данного энзима.
Генетические исследования ■ 653
Иначе говоря, в однозначных локусах гомологичных хромосом представлены альтернативные состояния одного и того же гена, ответственного за синтез данного фермента. Возникают подобные изменения вследствие мутации. Структура изоферментов генетически детерминирована. Обнаружение в крови определённой формы изофермента или его отсутствие указывает на тот генетический дефект, который лежит в основе заболевания.
В составе α2-глобулинов сыворотки крови содержится белок гаптоглобин (Hp). С помощью электрофореза удаётся выделить несколько типов этого белка. Наиболее часто обнаруживают типы Hp 1−1, Hp 2−1, Hp 2−2, различающиеся электрофоретической подвижностью и количеством белковых компонентов. Типы гаптоглобина генетически детерминированы. Они кодируются геном, расположенным в хромосоме 16 (16q22). В настоящее время установлена связь между различными типами гаптоглобина
иопределёнными формами онкологических заболеваний. Электрофоретический анализ ЛП с установлением типа ДЛП позволяет
заподозрить тот или иной генетически обусловленный дефект, лежащий в основе нарушения обмена ЛП и приводящий к развитию раннего атеросклероза.
Исследование гормонов (17-ГПГ, ТТГ, ингибина, свободного эстриола и др.) также играет важную роль в диагностике генетических заболеваний. Наследственные дефекты, лежащие в основе блока синтеза и метаболизма различных гормонов, рассмотрены в главе 9 «Гормональные исследования».
Иммунологические методы
Впоследнее время в качестве важного иммунологического маркёра популяционной генетики стали рассматривать главный комплекс гистосовместимости — HLA (Human Leukocyte Antigens). Аг этой системы определяют иммунологически в лейкоцитах крови. Комплекс генов HLA компактно расположен на коротком плече хромосомы 6 (6р21.3). Локализация этой системы и протяжённость расположения её локусов на хромосоме позволили рассчитать, что комплекс составляет приблизительно 1/1000 генофонда организма. Аг гистосовместимости участвуют в регуляции иммунного ответа организма, в поддержании иммунного гомеостаза. Благодаря своему полиморфизму и компактности локализации Аг HLA приобрели большое значение в качестве генетического маркёра.
Внастоящее время обнаружено более 200 аллелей этой системы, она является наиболее полиморфной и биологически значимой из генетических систем организма человека. Нарушения различных функций главного комплекса гистосовместимости способствуют развитию ряда заболеваний,
впервую очередь аутоиммунных, онкологических, инфекционных.
Всоответствии с расположением комплекса HLA в хромосоме 6 различают следующие локусы: D/DR, B, C, A (рис. 10-2). Сравнительно недавно обнаружены новые локусы G, E, H, F, их биологическую роль активно изучают в настоящее время. В главном комплексе гистосовместимости выделяют три класса Аг. Аг I класса кодируются локусами А, В, С. Новые локусы также относятся к этому классу. Аг II класса кодируются локусами DR, DP, DQ, DN, DO. Гены I и II классов кодируют трансплантационные Аг. Гены III класса кодируют компоненты комплемента (С2, С4а, С4b, Bf),
654 ■ Глава 10
Рис. 10-2. Схема расположения локуса главного комплекса гистосовместимости на коротком плече хромосомы 6 человека
а также синтез изоформ ряда ферментов (фосфоглюкомутазы, гликоксилазы, пепсиногена-5, 21-гидроксилазы).
Наличие у человека ассоциированных с определённым заболеванием Аг позволяет предполагать повышенную предрасположенность к данной патологии, а при некоторых корреляциях, наоборот, устойчивость к ней.
Определение Аг системы HLA проводят на лимфоцитах, выделенных из периферической крови, с помощью гистотипирующих сывороток в микролимфоцитотоксической реакции или молекулярно-генетическими методами.
Генетические исследования ■ 655
Установление ассоциативных связей между болезнями и Аг главного комплекса гистосовместимости позволяет:
■выделить группы повышенного риска развития болезни;
■определить её полиморфизм, то есть выявить группы больных с особенностями течения или патогенеза болезни; в этом же плане может проводиться анализ синтропии болезней, выяснение генетических предпосылок сочетания различных форм патологии; ассоциация с Аг, определяющими устойчивость к заболеваниям, позволяет выявлять лиц с пониженным риском возникновения данной патологии;
■проводить дифференциальную диагностику заболеваний;
■определять прогноз;
■выработать оптимальную тактику лечения.
Всвязи с тем, что для большинства болезней прямой связи с Аг главного комплекса гистосовместимости не прослеживается, для объяснения ассоциации между заболеваниями и Аг HLA была предложена теория «двух генов», согласно которой предполагается существование гена (генов) иммунного ответа (Ir-гена), тесно связанного с Аг HLA и генами, регулирующими иммунный ответ. Гены-протекторы определяют резистентность
кзаболеваниям, а гены-провокаторы — чувствительность к тем или иным болезням.
Втабл. 10-2 приведены данные о связи между различными заболеваниями и наличием Аг главного комплекса гистосовместимости. Относитель-
ный риск заболевания для лиц с соответствующим генотипом рассчитывают по формуле: x = [hp × (1 − hc)] / [hc × (1 − hp)], где hp — частота признака у больных, а hc — у лиц контрольной группы.
Относительный риск показывает величину ассоциации заболевания с определённым Аг/Аг системы HLA (даёт представление о том, во сколько раз выше риск возникновения заболевания при наличии Аг по сравнению с его отсутствием). Чем больше этот показатель у пациента, тем выше ассоциативная связь с заболеванием.
Таблица 10-2. Ассоциация болезней человека с HLA-Аг (частота гена,%) [Йегер Л., 1990; Фролькис А.В., 1995; Петрова М.А., 1997]
|
|
Контрольная |
Боль- |
Относи- |
|
Заболевания |
HLA |
тельный |
|||
группа,% |
ные,% |
||||
|
|
риск |
|||
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Ревматология |
|
|
|
|
|
Анкилозирующий |
В27 |
5−7 |
90−93 |
90−150 |
|
спондилит |
|
|
|
|
|
Синдром Райтера |
В27 |
6−9 |
69−76 |
32−49,6 |
|
Артриты, обусловленные |
|
|
|
|
|
инфекциями: |
|
|
|
|
|
− Yersinia |
В27 |
|
58−76 |
17,59 |
|
− Salmonella |
В27 |
|
60−69 |
17,57 |
|
Артрит псориатический |
В13 |
|
9−37 |
4,79 |
|
Ревматоидный артрит |
Dw4 |
12−19 |
48−72 |
3,9−12,0 |
|
|
DR4 |
20−32 |
70 |
4,9−9,33 |
656 ■ Глава 10
Продолжение табл. 10-2
Синдром Бехчета |
В5 |
13 |
48−86 |
7,4−16,4 |
СКВ |
В5 |
|
11−34 |
1,83 |
|
В8 |
|
19−48 |
2,11 |
|
Bw15 |
6−10 |
21−40 |
5,1 |
|
DR2 |
26,4 |
57,1 |
3,80 |
|
DR3 |
22,2 |
46,4 |
2,90 |
Синдром Гужеро−Шёгрена |
В8 |
|
38−58 |
3,15 |
|
Dw3 |
26 |
69−87 |
19,0 |
Кардиология |
|
|
|
|
ИБС |
В7 |
27,8 |
45,8 |
2,19 |
|
В14 |
7,5 |
14,8 |
2,14 |
|
В15 |
11,1 |
20,4 |
2,05 |
|
Сw4 |
18,7 |
32,8 |
2,12 |
Гипертоническая болезнь |
В18 |
10,4 |
22,6 |
2,52 |
|
Аw19 |
12,6 |
28,3 |
2,74 |
Эндокринология |
|
|
|
|
Сахарный диабет типа 1 |
В8 |
32 |
52−55 |
2,1−2,5 |
|
В18 |
|
5−59 |
1,65 |
|
В15 |
12 |
18−36 |
1,89−3,9 |
|
Dw3 |
26 |
48−50 |
2,9−3,8 |
|
Dw4 |
19 |
42−49 |
3,5−3,9 |
|
DR3 |
20 |
60 |
6,10 |
|
DR3/DR4 |
|
|
33 |
Гипертиреоз |
В8 |
21 |
35−49 |
2,34−3,5 |
|
D3 |
26 |
61 |
4,4 |
|
DR3 |
20 |
51 |
4,16 |
Подострый тиреоидит |
Bw35 |
13 |
63−73 |
16,81 |
(де Кервена) |
|
|
|
|
|
Dw1 |
|
33 |
2,1 |
Болезнь Аддисона |
В8 |
|
20−80 |
3,88−6,4 |
|
Dw3 |
26 |
70−76 |
8,8−10,5 |
Синдром Иценко− |
А1 |
|
49 |
2,45 |
Кушинга |
|
|
|
|
Гастроэнтерология |
|
|
|
|
Пернициозная анемия |
В7 |
19 |
26−52 |
1,7−3,1 |
|
DR5 |
6 |
25 |
5,20 |
Атрофический гастрит |
В7 |
|
37 |
2,55 |
Язвенная болезнь двенад- |
А2 |
48,1 |
61,3 |
1,7 |
цатиперстной кишки |
|
|
|
|
|
А10 |
20,6 |
63,3 |
6,65 |
|
В14 |
4,0 |
10,3 |
2,76 |
|
В15 |
6,6 |
24,4 |
4,56 |
|
В40 |
9,72 |
23,3 |
2,82 |
Генетические исследования ■ 657
Продолжение табл. 10-2
Аутоиммунный гепатит |
В8 |
16 |
37−68 |
2,8−4,1 |
|
|
DR4 |
24 |
71 |
7,75 |
|
Носители HBsAg |
Bw41 |
|
12 |
11,16 |
|
|
В15 |
|
10−19 |
0,29 |
|
Дерматология |
|
|
|
|
|
Псориаз |
Bw17 |
6−8 |
22−36 |
3,8−6,4 |
|
|
В13 |
3−5 |
15−27 |
4,2−5,3 |
|
|
Bw16 |
5 |
15 |
2,9 |
|
Герпетиформный дерматит |
В8 |
27−29 |
62−63 |
4,00−4,6 |
|
|
DR3 |
19 |
80 |
16,60 |
|
Склеродермия |
В7 |
24 |
35 |
1,7 |
|
Пузырчатка |
А10 |
|
|
3,1 |
|
Атопический дерматит |
В13 |
6,86 |
21,28 |
3,67 |
|
|
В27 |
9,94 |
25,53 |
3,11 |
|
|
А10/В13 |
0,88 |
8,51 |
10,48 |
|
Экзема |
А10 |
19,64 |
36,67 |
2,37 |
|
|
В27 |
9,94 |
26,67 |
3,29 |
|
Крапивница и отёк Квинке |
В13 |
6,86 |
21,21 |
3,65 |
|
|
В5,8 |
1,42 |
12,12 |
9,57 |
|
|
В5,35 |
0,71 |
6,06 |
9,02 |
|
Неврология |
|
|
|
|
|
Рассеянный склероз |
А3 |
25 |
36−37 |
2,7−2,8 |
|
|
В7 |
25−33 |
36−42 |
1,4−2,0 |
|
|
Dw2 |
16−26 |
60−70 |
4,3−12,2 |
|
|
DR2 |
35 |
51,2 |
1,95 |
|
|
DR3 |
20 |
32,5 |
1,93 |
|
Миастения |
В8 |
21−24 |
52−57 |
3,4−5,0 |
|
|
А1 |
20−25 |
23−56 |
3,8 |
|
|
DR3 |
26 |
50 |
2,5 |
|
Пульмонология |
|
3,55 |
12,5 |
3,88 |
|
Бронхиальная астма |
В21 |
4,62 |
12,5 |
2,95 |
|
(заболевшие в возрасте |
В22 |
9,94 |
19,64 |
2,22 |
|
19−30 лет) |
|||||
В27 |
12,31 |
37,5 |
4,27 |
||
|
|||||
|
В35 |
0,11 |
5,36 |
51,4 |
|
|
В27/35 |
0,47 |
7,14 |
16,2 |
|
Прочие заболевания |
|
|
|
|
|
Вазомоторный ринит |
А3 |
26,98 |
52,38 |
2,98 |
|
|
В17 |
7,57 |
28,57 |
4,88 |
|
|
А3/10 |
2,72 |
23,83 |
11,18 |
|
|
В7/17 |
0,47 |
9,52 |
22,28 |
658 ■ Глава 10
Окончание табл. 10-2
Поллинозный риносинусит |
А1 |
19,76 |
35,29 |
2,21 |
|
В8 |
14,91 |
32,35 |
2,73 |
|
В35 |
12,31 |
29,41 |
2,97 |
|
В8/35 |
1,53 |
8,82 |
6,22 |
|
А1/В35 |
2,39 |
14,71 |
7,04 |
Данные, приведённые в таблице 10-2, показывают, что наиболее сильные ассоциативные связи выявляются для болезней с полигенным или мультифакториальным типом наследования.
Таким образом, определение Аг главного комплекса гистосовместимости на клетках крови (лейкоцитах) позволяет выявить степень индивидуальной предрасположенности человека к определённому заболеванию, а в ряде случаев использовать результаты исследований для дифференциальной диагностики, оценки прогноза и выбора тактики лечения. Например, выявление Аг HLA-B27 используют в дифференциальной диагностике аутоиммунных болезней. Его обнаруживают у 90−93% пациентов европеоидной расы с анкилозирующим спондилитом и синдромом Райтера. У здоровых представителей этой расы Аг HLA-B27 выявляют всего в 5−7% случаев. Аг HLA-B27 часто обнаруживают при псориатическом артрите, хронических воспалительных заболеваниях кишечника, протекающих с сакроилеитом и спондилитом, увеите и реактивном артрите.
Молекулярно-генетические методы
Методы ДНК-технологии используют для выяснения локализации в той или иной хромосоме мутантного гена, ответственного за происхождение определённых форм наследственной патологии. Так как ген представляет собой участок ДНК, а мутация генов — повреждение первичной структуры ДНК (под мутацией понимают все изменения в последовательности ДНК, независимо от их локализации и влияния на жизнеспособность индивида), то, зондируя препараты метафазных хромосом больного с наследственным заболеванием, удаётся установить локализацию патологического гена. Методы молекулярной генетики создают возможности для диагностики болезней на уровне изменённой структуры ДНК, они позволяют выяснять локализацию наследственных нарушений. Молекулярно-генетические методы могут выявить мутации, связанные с заменой даже одного-единственного основания.
Важнейший этап идентификации гена — его выделение. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают: быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путём преципитации в этаноле.
В генетических лабораториях ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего у пациента забирают 5−20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором антикоагулянта (гепарин). Затем отделяют лейкоциты и проводят их обработку по изложенным выше этапам.
Генетические исследования ■ 659
Следующий этап подготовки материала к исследованию — «разрезание» ДНК на фрагменты в участках со строго специфической последовательностью оснований, которое осуществляют с помощью бактериальных ферментов — рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз). Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4−6, реже 8−12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разделяют её на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов — характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, и каждый из этих ферментов узнаёт свою специфическую последовательность нуклеотидов. В дальнейшем сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркёров ДНК. Образовавшиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путём электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, а тем самым может быть определена их молекулярная масса. Обычно для выявления ДНК в геле используется специфическое окрашивание (чаще бромидом этидия) и просмотр геля в проходящем свете ультрафиолетовой области спектра. Места локализации ДНК имеют красную окраску. Однако у человека при обработке ДНК несколькими рестриктазами образуется так много фрагментов различной длины, что их не удаётся разделить с помощью электрофореза, то есть не удаётся визуально идентифицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме (получают равномерное окрашивание по всей длине геля). Поэтому для идентификации нужных фрагментов ДНК в таком геле используют метод гибридизации с мечеными ДНК-зондами.
Любой одноцепочечный сегмент ДНК или РНК способен связываться (гибридизироваться) с комплементарной ему цепью, причём гуанин всегда связывается с цитозином, аденин с тимином. Так происходит образование двухцепочечной молекулы. Если одноцепочечную копию клонированного гена пометить радиоактивной меткой, получится зонд. Зонд способен отыскивать комплементарный сегмент ДНК, который затем легко идентифицировать с помощью радиоавтографии. Радиоактивный зонд, добавленный к препарату растянутых хромосом, позволяет локализовать ген на определённой хромосоме: с помощью ДНК-зонда можно идентифицировать определённые участки при саузерн-блоттинге. Гибридизация происходит, если тестируемый участок ДНК содержит нормальный ген. В случае, когда присутствует ненормальная последовательность нуклеотидов, то есть соответствующие структуры хромосомы содержат мутантный ген, гибридизация не произойдёт, что позволяет определить локализацию патологического гена.
Для получения ДНК-зондов используют метод клонирования генов. Сущность метода состоит в том, что фрагмент ДНК, соответствующий ка- кому-либо гену или участку гена, встраивают в клонирующую частицу, как правило, бактериальную плазмиду (кольцевая внехромосомная ДНК, присутствующая в клетках бактерий и несущая гены устойчивости к антибиотикам), и затем бактерии, имеющие плазмиду со встроенным человеческим
Генетические исследования ■ 661
участок ДНК (то есть любой интересующий ген) более чем в 200 000 раз. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК-материал одной клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать (использование радиоактивных зондов после электрофореза не требуется). Необходимое условие для проведения ПЦР — знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК для правильного подбора искусственно синтезированных праймеров.
Внастоящее время ПЦР представляет собой процесс, протекающий
водной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть идентифицированы методом электрофореза. Один из ключевых
компонентов реакции — «праймеры» — синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 20−30 оснований, комплементарных «сайтам» (участкам) отжига (присоединения) на идентифицируемом участке матричной ДНК.
ПЦР протекает автоматически в программируемом термостате — термоциклере (амплификаторе). Трёхступенчатый цикл, в результате которого
получаются точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяют 30−50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в реакционной смеси. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не вследствие изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразной границы амплифицированного участка, что и определяет размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
Вкачестве метода детекции полученных молекул ДНК используют электрофорез, с помощью которого производится разделение амплифицированного материала по размеру ампликонов (продуктов амплификации).
С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК.
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ
Широкое использование различных рестрикционных эндонуклеаз для анализа хромосомной ДНК выявило огромную вариабельность генома человека. Даже небольшие изменения в кодирующих и регуляторных областях структурных генов могут привести к прекращению синтеза определённого белка или к потере его функции в организме человека, что, как правило, сказывается на фенотипе пациента. Однако приблизительно 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, которые более изменчивы и содержат множество так называемых нейтральных мутаций, или полиморфизмов, и не имеют фенотипического выражения. Такие полиморфные участки (локусы) используются в диагностике наследственных заболеваний в качестве генетических маркёров. Полиморфные локусы присутствуют во всех хромосомах и сцеплены с определённым участком