6.2. Атомно-абсорбційна спектрофотометрія.

Метод базується на явищі поглинання світла атомами елементів, що визначаються, які знаходяться у пароподібному стані. Атомізація проби відбувається у полум’ї газового пальника або у графітовій кюветі, що знаходиться у атмосфері інертного газу і нагрівається до високої температури.

Рис.6.2.1. Схема атомно-абсорбційного спектрофотометра. До складу приладу входять: джерело живлення (1) – генератор високої напруги або високої частоти; джерело випромінювання (2) – лампа з порожнистим катодом або безелектродна газорозрядна лампа; модулятор (3) – перериває світловий потік з певною частотою; атомізатор (4) – полум’я газового пальника або графітова кювета; монохроматор (5) – виділяє зі світлового потоку спектральну лінію хімічного елемента, що визначається; фотоелемент (6) або фотоелектронний помножувач, що перетворює світловий потік в електричний сигнал; підсилювач (7); реєструючий пристрій (8).

Лампа з порожнистим катодом або газорозрядна лампа містить атоми саме того елемента, який треба визначити у пробі. Вони збуджуються від електричного розряду і випромінюють кванти світла з такою довжиною хвилі, яку здатні поглинати у атомізаторі тільки атоми того самого хімічного елемента. Усі інші елементи, що присутні в атомізованій пробі, мають атоми з іншою електронною будовою і не здатні поглинати це випромінювання, отже не заважають визначенню. Завдяки цій особливості випромінювання і поглинання метод має високу селективність (вибірковість). Але таке джерело випромінювання досить дороге і його треба замінити, якщо, визначивши один елемент, треба визначати іншій. Існують прилади з кількома лампами, які почергово можна змінювати, але потрібен час на розігрівання лампи перед вимірюванням. Існують лампи з кількома хімічними елементами, спектри яких не перекриваються.

Монохроматор виділяє зі світлового потоку ту спектральну лінію хімічного елемента, яка забезпечує найбільшу чутливість визначення. Це лінія, яка відповідає найбільш вірогідним електронним переходам у атомі даного хімічного елемента, так звана резонансна лінія. Температура і тиск, за яких атоми випромінюють у лампі, на порядок менші температури і тиску в атомізаторі, де відбувається поглинання. Тому ширина лінії поглинання удвічі більша, ніж ширина лінії випромінювання. За таких умов величина, що характеризує абсорбцію (A) світла в атомізаторі, згідно основному закону поглинання, пропорційна концентрації елемента, що поглинає: A = lg(I₀/I)= k·L·c, де I₀ – інтенсивність спектральної лінії до поглинання; І – після поглинання; L – товщина шару, де поглинається світло в атомізаторі;·c – концентрація атомів, що поглинають; k – коефіцієнт поглинання. Він на 2-3 порядки більше відповідного коефіцієнта у молекулярній абсорбції, що означає високу чутливість методу.

На чутливість визначення впливає також фон – випромінювання атомізатора, де може відбуватися не тільки поглинання, але і випромінювання світла атомами елемента, що визначається, які збуджуються за рахунок високої температури, як в атомно-емісійній спектрометрії. Модулятор перериває світловий потік від лампи з певною частотою, а реєструючий пристрій синхронізований з ним і реагує тільки на перевний сигнал, він вилучає постійний сигнал від атомізатора. Таким чином можна підвищити чутливість методу.

Межа визначення для деяких елементів досягає 10^-11 – 10^-12г, а відтворюваність результатів – кількох процентів. Тривалість і трудомісткість аналізу також невелика, тому що завдяки високій специфічності методу можна уникнути операції відокремлення багатьох сторонніх речовин під час підготовки проби. Для найбільш доступних газових сумішей, що дають полум’я не дуже високої температури, кількість елементів, які можна визначати методом атомної абсорбції, значно більша, ніж методом полуменевої фотометрії (атомної емісії), оскільки роль плазми (полум’я) обмежена тільки атомізацією (без збудження). За таких температур атомізується більшість металів, не здатних випромінювати у зв’язку з високим потенціалом збудження їхніх резонансних ліній (Cu, Pb, Cd, Ag та ін.). Спектр поглинання атомів простіше емісійного, оскільки складається тільки зі спектральних ліній резонансної серії. Певні обмеження методу – це складність апаратури, висока її ціна і необхідність відповідної кваліфікації персоналу лабораторії.

6 .3. Молекулярно-абсорбційна спектрофотометрія базується на явищі поглинання світла молекулами забарвленої речовини у розчині. 6.3.1.Спектр поглинання і вибір довжини хвилі для вимірювань. Кожна речовина здатна поглинати електромагнітне випромінювання з такою енергією квантів, яка відповідає хімічній (електронній) будові її молекул. Інша речовина, маючи іншу будову молекул, поглинає кванти світла з іншою енергією Спектр поглинання певної речовини – це залежність поглинання цією речовиною світла від його довжини хвилі λ (або частоти ν). На відміну від атомних спектрів, молекулярні мають вигляд не лінії, а широкої смуги з максимумом. Довжина хвилі, яка відповідає максимальному поглинанню світла даною речовиною, позначається λ_max. Якщо у розчині є інша речовина з іншим забарвленням, вона має інший спектр поглинання і іншу λ_max(2). Вимірюючи поглинання світла при λ_max(х) і λ_max(у), можна визначати дві різнозабарвлені речовини Х та Y в одному розчині. Наші очі сприймають елекромагнітне випромінювання тільки у діапазоні приблизно від 400 до 750 нм. Усі речовини, які поглинають за цими межами, сприймаються нами як незабарвлені. Забарвлення речовини є додатковим до того, що поглинається. Червоний розчин саме тому червоний, що червоного не поглинає, а поглинає синьо-зелений колір, а все, що не поглинається і проходить, сприймається нами, як червоний – додатковий до синьо-зеленого.

Рис.6.3.1.Спектри поглинання двох різнозабарвлених речовин.

6.3.2.Різні назви одного методу. Прилад та принцип вимірювань. У той період розвитку цього методу, коли ще не було приладів і забарвлення сприймалося візуально, він отримав назву “колориметрія” (вимірювання кольору). Очима не можна було визначити на скільки один розчин відрізняється від іншого, а тільки встановити приблизну рівність інтенсивності забарвлення стандартного і досліджуваного розчинів розробленими для цього методами шкали, розведення, колориметричного титрування та ін. Перші прилади (колориметри) також різними способами (приміром, за допомогою діафрагми) урівнювали інтенсивність забарвлення, яке сприймалося очима. З появою фотоелементів з’явилась можливість вимірювати поглинання електромагнітного випромінювання у більш широких межах, ніж 400 – 750 нм, і прилад отримав назву фотометр, а метод – фотометричний аналіз (фотометрія – вимірювання світла). З появою монохроматора (замість світлофільтра) і можливості знімати спектри поглинання, з’явилась назва “спектрофотометр” (відповідно “спектрофотометрія”). Але відомі інші методи, де вимірюється інтенсивність світлового потоку за допомогою фотоелементів (а потім і фотопомножувачів), приміром, фотометрія полум’я, атомно-абсорбційна спектрофотометрія. Тому точна назва приладу “фотоелектроколориметр”, а методу – молекулярно-абсорбційна спектрофотометрія інколи спрощується на колориметр і колориметрія, а назви «фотометричний аналіз» і “спектрофотометрія” тепер можна вважати неточними.

I₀ I

L

1 2 3 4 5

Рис 6.3.2. Схема приладу для вимірювання світлопоглинання:

1 – джерело випромінювання; 2 –світлофільтр у фотоелектроколориметрі, або монохроматор у спектрофотометрі; 3 – кювета із забарвленим розчином, яка може замінюватись на таку ж кювету з розчином порівняння; 4 – фотоелемент перетворює світловий потік в електричний сигнал; 5– реєструючий пристрій.

6.3.3.Основні величини, які характеризують поглинання світла, це світлопропускання (T) і оптична густина (D – density або А – absorption): T= I/I₀, D(A) = lg(I₀/I). При вимірюванні оптичної густини D або світлопропускання T треба порівняти інтенсивність світлового потоку до (I₀) і після (I) поглинання. Але встановити фотоелемент до і після кювети з досліджуваним розчином неможливо, тому спочатку у світловий потік встановлюють кювету з розчином порівняння і вважають цей сигнал І₀, а потім – кювету такої ж довжини L з досліджуваним розчином і вважають цей сигнал як І.

Аналітичним сигналом для визначення забарвлених речовин може бути тільки оптична густина, тому що саме вона прямо пропорційна концентрації відповідно до основного закону світлопоглинання. У логарифмічній формі цей закон (закон Бугера-Ламберта-Бера) має такий вигляд: D(А) = lg(I₀/I)= ε_λ∙L∙C, де C – молярна концентрація забарвленої речовини у розчині; L – довжина кювети, точніше, товщина шару, де відбувається поглинання (абсорбція) світла; ε_λ – молярний коефіцієнт світлопоглинання, який характеризує індивідуальні властивості кожної забарвленої речовини, перш за все – залежність поглинання від довжини хвилі λ (див. вище – спектр поглинання). Якщо концентрація забарвленої речовини виражена не в моль/л, а інакше, приміром, мг/л, коефіцієнт світлопоглинання позначається k.

6.3.4. Молярний коефіцієнт світлопоглинання визначає чутливість колориметричного визначення, тобто найменшу концентрацію забарвленої речовини, яку можна визначити. Якщо визначати концентрацію за основним законом світло поглинання, то С_min = D_min/ε_λ∙L_max, отже, що більший ε_λ, то меншу концентрацію можна визначити, то вище буде чутливість визначення. Макро- і мікроелементи у харчових продуктах визначають, переводячи їх у забарвлені комплексні сполуки. З різними аналітичними реагентами один мікроелемент дає різні комплексні сполуки з різним ε_λ. Приміром, іони Cu²⁺ утворюють синій комплекс з аміаком. Цей комплекс має максимум поглинання при λ = 620 нм і ε₆₂₀ = 120, отже С_min = D_min/ε_λ∙L_max =0,1/120∙5 = 1,67∙10^-4 (моль/л). У цих розрахунках вважаємо, що надійно можна виміряти D_min = 0,1, а кювета може мати найбільшу довжину∙L_max = 5 см. Але у таблиці «Фотометричні методи визначення різних іонів» довідника з аналітичної хімії для Cu²⁺ наведені кілька реактивів, які дають комплекси з Cu²⁺ зі значно більшими значеннями молярного коефіцієнта світло-поглинання. Після мінералізації харчових продуктів Cu²⁺ найчастіше визначають з диетилдитіокарбаматом, який утворює з Cu²⁺ жовтий комплекс. Цей комплекс має максимум поглинання при λ = 440 нм і ε₄₄₀ = 12000. Отже С_min = D_min/ε_λ∙L_max =0,1/12000∙5 = 1,67∙10^-6 (моль/л). Отже, межа визначення зменшується, а чутливість збільшується у 100 раз, якщо ε збільшується у 100 раз.

6.3.5. Методи визначення концентрації. Закон Бера точно виконується тільки для монохроматичного випромінювання і тільки у цьому випадку можна розраховувати концентрацію досліджуваного розчину, вимірявши оптичну густину і знаючи точну довжину кювети за значенням молярного коефіцієнта світлопоглинання С = D/ε_λ∙L (моль/л). Але величина цього коефіцієнта часто залежить від хімічного складу розчину (концентрації реактиву, який додають у певному надлишку, тощо), тому визначення найчастіше проводять за тими методами обробки аналітичного сигналу, що були розглянуті вище (градуювальний графік, метод добавок, порівняння з одним або двома стандартними розчинами). Оптична густина D = lg(I₀/I) може змінюватись від 0 (якщо I = I₀) до ∞ (якщо I = 0), але вимірювати її на звичайних колориметрах можна від 0 до 1,5 (найбільша точність вимірювання зі звичайним фотоелементом при її значенні близько 0,4). Тому кювету вибирають так, щоб оптична густина не перевищувала 1,0.

Якщо ж і за найменшої кювети оптична густина значно більша 1,0, використовують метод так званої «диференційної фотометрії» (або диференційної спектрофотометрії). Цей спосіб вимірювання полягає у тому, що як розчин порівняння використовують забарвлений розчин тієї ж речовини відомої концентрації. Отже, у такий спосіб вимірюють відносну оптичну густину, або збільшення оптичної густини досліджуваного розчину у порівнянні зі стандартним. Якщо воно не перевищує 1,0, вимірювання вважають точним.

В об’єктах харчової, біотехнології та довкілля колориметрично визначають забарвлені речовини, або речовини, які можна перевести у забарвлені сполуки, виконавши певні аналітичні реакції. Ці речовини поглинають електромагнітне випромінювання у межах довжин хвиль, доступних для вимірювання на приладі. Значно менше речовин мають здатність, поглинувши квант світла з більшою енергією, випромінювати світло іншого кольору, з меншою енергією квантів. Такі речовини визначають методом молекулярної емісії, який частіше називають люмінесцентним аналізом.