8.Хроматографiя

Для удосконалення технологiчних процесiв харчової промисловостi та визначення хімічного складу харчових продуктiв, об’єктів біотехнології та довкілля виникає потреба роздiлити та визначити дуже близькі за своїми хiмiчними властивостями, але рiзнi за бiологiчною активнiстю речовини. Найбiльш поширеним, а iнколи єдиним засобом для цього є хроматографiя. Цей метод дозволяє швидко i ефективно вирiшувати такi задачi, якi іншими методами не можна розв’язати.

Хроматографiю можна визначити як метод роздiлення складних сумiшей, який базується на рiзних швидкостях руху окремих компонентiв сумiшi крiзь нерухому фазу пiд дiєю рухомої фази. Рухомою фазою може бути газ або рiдина, а нерухомою – пористе або гранульоване тверде тiло або тонкий шар рiдини, адсорбований на твердому тiлi. Вiдповiдно до агрегатного стану рухомої фази хроматографiя може бути газова (ГХ) або рiдинна (РХ).

Словом «хроматографiя» позначають також наукову дисциплiну, яка вивчає цей процес, розробляє методику i апаратуру. Розрiзняють аналiтичну i препаративну хроматографiю. В аналiтичнiй хроматографiї пiсля хроматографiчного роздiлення проходить тiльки реєстрацiя кiлькостi кожного компонента, в той час як у препаративнiй хроматографiї компоненти пiсля роздiлення збираються для подальшого використання. Препаративна хроматографiя набуває все бiльшого значення для одержання хроматографiчно очищених біологiчно активних речовин, якi використовуються при виготовленнi лiкарських препаратiв i деяких харчових продуктів. 8.1.Газова хроматографiя.

Усі види хроматографії, де рухомою фазою є газ, об’єднують назвою “газова хроматографія” (ГХ). За природою нерухомої фази розрiзняють два види ГХ. В одному з них, що називається газотвердофазною хроматографiєю (ГТХ), нерухомою фазою є тверда речовина (гранульований силiкагель, оксид алюмiнiю або полімер). Основою процесу роздiлення є адсорбцiя на поверхнi твердого тiла, тому цей метод називають iнколи газо-адсорбцiйною хроматографiєю. Вiн має дуже обмежене застосування, головним чином для роздiлення простих газiв i низкокiплячих вуглеводнiв.

Значно ширше застосування має газо-рiдинна хроматографiя (ГРХ), в якiй нерухомою фазою є нелетка рiдина (найчастіше – полімер), що утримується у виглядi тонкоi плiвки на твердому носiї, iнертному до хроматографiчного процесу. У цьому видi ГХ значно розширюється кiлькiсть i якiсть речовин, що можуть використовуватись як нерухома фаза, i значно пiдвищується вiдтворюванiсть результатiв.

8.1.1. Газовий хроматограф.

Основнi вузли газового хроматографа показанi на схемi (рис.8.1.1). Газ-носiй (рухома фаза) з балону 1 через редуктор 2 i блок пiдготовки газу 3 пропускається через усю систему безперервно на протязi усього дослiду. Газ-носiй повинен вiдповiдати певним вимогам: забезпечувати необхiднi дифузiйнi характеристики, що визначають ефективнiсть хроматографiчної колонки; вiдповiдати чутливостi i принципу дiї детектора; бути iнертним щодо речовин, якi аналiзуються, нерухомоi фази, матерiалу колонки і детектора. Як газ-носiй використовують гелiй, азот, водень, аргон та iн. гази. Вони очищуються вiд домiшок у блоцi пiдготовки газу 3.

Дозатор 4 – це пристрiй (випаровувач), який дозволяє швидко ввести невелику пробу речовини, що аналiзується, у хроматографiчну колонку. Рiдкi проби (0.1–10мкл) мiкрошприцем уприскують через отвiр, герметично закритий гумовою (силiконовою) прокладкою, крізь яку можна ввести голку шприца (прокладку перiодично замiнюють). Проба потрапляє у випаровувач, нагрiтий вище температури кипiння проби. Для уведення проб твердих речовин i газiв запропонованi спецiальнi пристрої. Підготовка проби забезпечує відсутність речовин, які виводять з ладу колонку або детектор.

Разом з потоком газу-носiя проба у пароподiбному станi поступає у хроматографiчну колонку 5, яка являє собою скляну або металеву трубку дiаметром 1-3 мм i довжиною 1-3 м у виглядi спiралi, щоб її зручнiше можна було розмiстити у термостатi хроматографа 6. У газотвердофазній хроматографiї (ГТХ) колонку заповнюють подрiбненою (або гранульованою) твердою речовиною, що здатна адсорбувати на своїй поверхнi компоненти проби, якi треба роздiлити; у газо-рiдинній хроматографiї (ГРХ) – твердим носiєм, поверхня якого вкрита тонким шаром полімеру, який у певних температурних межах грає роль нелеткої рiдини, що і є нерухомою фазою. Діаметр гранул повинен бути у 20-30 раз меншим за діаметр колонки. Капiлярнi колонки виготовляють з дуже довгої трубки (50-100 м) малого дiаметру (0,1-0,2 мм), внутрiшнiй канал якої вкритий тонким шаром рiдкої фази. Процес перемiщення речовини разом з газом-носiєм уздовж колонки називається елюванням («вимиванням»), а газ-носiй грає роль елюента.

Термостат 6 призначений для точного регулювання температури колонки, вiн пiдключений до блоку регулювання температури 7 (регулюється також температура дозатора i детектора). Оптимальна температура колонки, що приблизно дорiвнює середнiй температурi кипiння проби або трохи вище, забезпечує зручний час елювання (10-30 хв). Для роздiлення сумiшi речовин, що мають широкий iнтервал температур кипiння, оптимальним є підвищення температури колонки пiд час роздiлення (приміром, від 80ºС до 320ºС) за певною програмою – програмування температури: при нижчих температурах розділяються низькокиплячі компоненти, а з підвищенням температури з колонки у певній послідовності виходять менш леткі сполуки.

Компоненти проби пiсля роздiлення з колонки потрапляють у детектор 8. У ньому виникає сигнал, який повинен бути пропорцiйним концентрацїї або кiлькостi речовини, що з’являється у газi-носiї. Інтервал часу, за який хроматографiчна зона проходить через детектор, складає секунду або менше, тому детектор повинен мати малу iнерцiйнiсть, високу чутливiсть i вiдтворюванiсть. Найбiльш широко у ГХ застосовуються такі детектори. ДТП – детектор за теплопровiднiстю (катарометр) вимірює електричний опір тонких платинових дротинок (або напівпровідникових термісторів),які розміщені у потоці газу-носія (гелію), що виходить з колонки. Опір залежить від температури провідника, а температура – від теплопровідності газу (елюату), що омиває провідник. Гелій Не – це одноатомний газ з дуже високою теплопровідністю і як тільки у ньому з’являється інша речовина (компонент проби), теплопровідність різко зменшується, а опір зростає. ДТП – це універсальний детектор, що реагує на будь-яку речовину, теплопровідність якої відрізняється від теплопровідності гелію, він не руйнує пробу, але його чутливість менша ніж у далі наведених детекторів

Рис.8.1.1. Схема газового хроматографа.

1 – балон з газом-носієм; 2 – редуктор; 3 – блок пiдготовки газу; 4 – дозатор (випаровувач); 5 – хроматографiчна колонка; 6 – термостат; 7 – блок регулювання темпетатури; 8 – детектор; 9 – пiдсилювач; 10 – комп’ютер (самописець).

.

ДІП – детектор iонiзацїї у полум’ї має маленький водневий пальник, розташований у сильному електричному полі. Компоненти суміші на виході з колонки потрапляють у пальник, піроліз органічних сполук у полум’ї дає проміжні іонні сполуки, які в електричному полі створюють струм іонізації. ДІП має високу чутливість до всіх органічних сполук (тобто сполук зі зв’язками С–С і С–Н). ДІП не чутливий до води, тому зручний для аналізу водних проб.

ДЕЗ – детектор електронного захоплення має джерело радіоактивного β-випромінювання (ізотоп ⁶³Nі), яке іонізує газ-носій (азот особливо очищений від О₂) з утворенням електронів, які швидко рухаються до аноду. Якщо з колонки разом з газом-носієм у ДЕЗ потрапляє речовина з високою здатністю захоплювати електрони, утворюються негативно заряджені іони, які рухаються в електричному полі значно повільніше. Струм іонізації зменшується пропорційно концентрації речовини, що захоплює електрони. ДЕЗ має високу специфічність до речовин, молекули яких містять атоми елементів з високою спорідненістю до електронів, перш за все – галогенів, і використовується при визначенні залишків хлорорганічних пестицидів у харчових продуктах. ДЕЗ малочутливий до гексану та інших вуглеводнів, які використовують для екстракції залишків пестицидів з проби.

Сигнал детектора 8 пiсля пiдсилення 9 реєструється самописцем (або комп’ютером) 10, який фiксує цей сигнал у виглядi хроматограми (мал.8.1.2).

Рис.8.1.2. Кiлькiснi характеристики хроматограми.

Таким чином, хроматограма – це графiчне вiдображення залежностi сигналу детектора вiд часу елювання (або об’єму елюату) з моменту уведення проби.

8.1.2.Хроматограма та ефективнiсть хроматографічної колонки. Для того, щоб досягти кращого роздiлення компонентiв, пробу треба уводити у колонку у виглядi невеликоi дози, щоб усi компоненти починали рухатися уздовж колонки в один i той же момент часу. Рiзнi компоненти рухаются з рiзною швидкiстю, тому що вони мають рiзне спорiднення до нерухомоi фази i по-рiзному утримуються нею. Завдяки рiзнiй швидкостi руху вони проходять усю довжину колонки за різний час t_R (R-retention, утримання). Довша колонка сприяє кращому роздiленню компонентів але одночасно вiдбувається розширення (розмивання) зони, яку займає кожний окремий компонент, i вiдповiдних пiкiв на хроматограмi. Це явище знижує ефективнiсть роздiлення компонентiв, тому довжину колонки обмежують.

Ефективнiсть хроматографiчного процесу, що проходить у певнiй колонцi з довжиною L, характеризують числом теоретичних тарiлок N i висотою Н, що еквiвалентна теоретичнiй тарiлцi (ВЕТТ). Цю назву запозичено з iншого методу роздiлення – ректифiкацiї, де у ректифiкацiйнiй колонцi iснують реальнi тарiлки. У ГХ-колонцi ВЕТТ (висота, еквівалентна теоретичній тарілці) – це уявне (абстрактне) поняття, що вiдповiдає довжинi такої дiлянки колонки, на якiй за певних умов (швидкiсть потоку, температура та iн.) може встановитись рiвновага мiж речовиною, що знаходиться в рухомiй i нерухомiй фазах.

Для досягнення високої ефективностi роздiлення бажано, щоб число N теоретичних тарiлок було б досить великим. Тому, щоб колонка не була занадто довгою, ВЕТТ повинна бути якнайменшою. Чим нижче ВЕТТ, тим ефективнiша колонка.

Число теоретичних тарiлок у колонцi визначається спiввiдношенням N=16(t/w)². Величини t i w, якi визначенi на рис.8.1.2. треба виражати в однакових одиницях i зручно вимiрювати на хроматограмi у мiлiметрах. Далi визначають ВЕТТ як H=L/N. У зв’язку з тим, що для даноi системи Н – величина постiйна, з наведених вище спiввдношень витiкає, що t i w повиннi змiнюватись одночасно, тому для кiлькох пiкiв на однiй хроматограмi, чим бiльше утримання (чим довше t), тим бiльше w i тим ширшi пiки. Для кращого роздiлення бажано, щоб w, а значить i H, були б якомога меншими.

Положення пiкiв на хроматограмi (t_R) використовується для iдентифiкацiї (розпiзнавання) компонентiв, а площина пiд пiками характеризує кiлькiсть кожного компонента. При автоматичнiй реєстрацiї хроматограм можна безпосередньо вимiряти час утримання t_R (рис8.1.2), тобто час вiд введення проби до моменту реєстрацiї максимуму на хроматограмi. Об’єм газу-носiя, який потрiбен для елювання речовини до її максимальної концентрацiї, називають об’ємом утримання V_R: V_R = t_R F,

де F – об’ємна швидкість газу-носiя (см³/с).

Нерухома рідка фаза за своєю природою повинна бути добрим розчинником для усiх компонентiв сумiшi, що розділяється, але спорідненість молекул різних компонентів до цієї фази повинна бути рiзною. У цьому випадку коефiцiєнт розподiлу К між рухомою і нерухомою фазами (а значить і об’єм утримання) для кожного компонента буде мати своє значення, що вiдрiзняється вiд iнших, i роздiлення стане можливим.Для двох компонентiв А i B фактор роздiлення дорiвнює вiдношенню коефiцiєнтiв розподiлу: a_В/А= К_В/К_А, де у чисельнику знаходиться бiльший коефiцiєнт. (Компонент, що має бiльше значення К, має бiльше значення об’єму утримання i виходить з колонки пiзніше). Чим бiльше a_В/А, тим бiльше можливiсть повного хроматографiчного роздiлення двох речовин. Якщо фактор розділення дорівнює 5-10, повного розділення двох компонентів можна досягти навіть на малоефективній колонці. А на високоефективних колонках, що використовуються у сучасній хроматографії, розділення можливе навіть якщо фактор розділення не більше ніж 1,1.

Ідентифікація компонентів після розділення базується на вимірюванні часу утримання, але ці величини залежать від багатьох факторів, постійність яких треба контролювати для відтворюваності результатів. Зручними є величини відносних часів утримання, коли утримання будь-якого компоненту В виражають відносно якоїсь певної сполуки А, яка вводиться одночасно з пробою:

r_B/A=V_R(B)/V_R(A) = t_R(B)/t_R(A) = K_C(B)/K_C(A) = a_В/А,

де r – відносне утримання. Коливання більшості факторів однаково впливають на утримання А і В, тому відносне утримання залежить тільки від температури колонки і природи нерухомої фази.

Для кількісного визначення компонентів можна використати висоту піка h або площину під ним S , які пропорційні кількості відповідного компонента у пробі. Більш надійним параметром є площина, але для речовин з малим часом утримання, які дають вузькі і високі пікі, площину визначити важко, тому у цьому випадку висота піка є кращим параметром.

При побудові калібрувального графіка по осі ординат відкладають не абсолютне значення висоти (або площини) піка, а відношення цього параметра для компонента, що визначається, до висоти (або площини) піка для внутрішнього стандарта, що одержується на тій самій хроматограмі. Як внутрішній стандарт використовують сполуку, яка відсутня у пробі, повністю відділяється від інших компонентів, не взаємодіє з ними. Внутрішній стандарт уводять в усі стандартні розчини, що готують для побудови калібрувального графіка, і у пробу, що аналізується (точно однакову кількість). Оскільки відносні площини піків двох речовин не залежать від коливань в умовах досліду, метод внутрішнього стандарту дозволяє уникнути багатьох інструментальних помилок.

8.1.3. Газовий хроматограф і мас-спектрометр. Таке поєднання (ГХ-МС) газового хроматографа з мас-спектрометром як своєрідного детектора для речовин, що виходять з колонки (особливо для капілярних колонок), дає змогу ідентифікувати і визначати десятки і сотні органічних сполук в одній пробі. Мас-спектрометр працює за таким принципом: проба, що містить органічні речовини у газовій фазі, потрапляє внаслідок дифузії у систему низького тиску приладу («вакуум») і іонізується електронним ударом з енергією 10-100 еВ. Молекули руйнуються і виникають позитивно заряджені іони, які прискорюються у магнітному полі. Поле розсіює ці фрагменти молекул і дозволяє виміряти відносну розповсюдженість іонів з певним відношенням маси до заряду. Запис розповсюдженості іонів залежно від маси і називають мас-спектром (який не має ніякого відношення до оптичних спектрів). Він має високу відтворюваність і є фундаментальною характеристикою кожної конкретної молекули, як відбитки пальців у людини.

8.1.4.Застосування газової хроматографії. Головна вимога до сполук, які розділяються у газовому хроматографі – це достатня їхня стійкість при температурі, яка необхідна для підтримання речовини у газоподібному стані. Історично першим (1952 р.) було розділення і визначення складу жирних кислот у харчових продуктах методом ГРХ. Сучасна методика полягає у тому, що після екстракції ліпідів і визначення їхнього фракційного складу, проводять метаноліз гліцеридів розчином КОН у метанолі. Після кількісного перетворення жирних кислот у метилові ефіри розділення стає більш ефективним, проходить при нижчих температурах протягом меншого часу.

Дериватизація (утворення похідних) – це аналітична реакція кількісного перетворення речовин, що визначаються, у леткі похідні, які потім уводяться у хроматограф. Вона стала основою більшості методів ефективного розділення і визначення як основних компонентів харчових продуктів, так і добавок і забруднень, які визначають якість. Утворення складних ефірів жирних кислот є прикладом етерифікації.

При хроматографічному розділенні цукрів вперше було застосовано силанізацію (силілювання) – уведення триметилсилільних (ТМС) груп -Si(CH₃)₃ замість лабільних атомів гідрогену. Цей підхід – одержання ТМС-похідних – придатний для розділення і визначення багатьох класів сполук. Для проведення реакції використовують розчин триметилхлорсилану (СН₃)₃SiCl та гексаметилдисилазану (CH₃)₃Si–NH–Si(CH₃)₃ у піридині C₅H₅N, звільненому від будь-яких домішок води. Відбувається заміщення атомів гідрогену в групах –ОН, –SH, –NH₂. Нелеткі органічні сполуки перетворюються на леткі похідні, які можна уводити у хроматограф і успішно розділяти у хроматографічній колонці на відповідних силіконових фазах. Приміром, для лимонної кислоти утворення ТМС-похідних:

СН₂–СООН СН₂ – СООSi(CH₃)₃

І I

НО–С–СООН + 4 (СН₃)₃SiCl →(СН₃)₃SiО–С–СООSi(CH₃)₃ + 4HCl

І I

СН₂–СООН СН₂–СООSi(CH₃)₃

На колонці довжиною 2 м з сіліконовою фазою SE-30 можна розділити і визначити у вигляді ТМС-похідних більше 10 нелетких органічних кислот: щавлеву, янтарну, яблучну, винну, лимонну та ін.

Цікавим прикладом дериватизації є визначення амінокислот. Вони існують у вигляді нелетких біполярних іонів, які шляхом етерифікації та ацилювання переводять у леткі похідні – N-трифторацетил-n-бутилові ефіри (ТАБ-ефіри):

H H H H

| | C₄H₉OH | (CF₃CO)₂O |

R-C –COO^-« R-C-COOH R-C–COOC₄H₉ R-C-COOC₄H₉

| | (НСІ) | |

NH₃⁺ NH₂ NH₂ H - N – COCF₃

Якщо для ацилювання використовувати ангідриди фтор-заміщених кислот – трифтороцтової, гептафтормасляної та ін.. – утворюються похідні, що містять атоми фтору. При використанні детектора електронного захоплення (ДЕЗ) методом ГХ можна реєструвати у 1000 разів менші кількості органічних сполук у вигляді галогенпохідних, ніж ці сполуки без дериватизації з ДІП.

Яблучний сік містить менше 1% амінокислот, але визначення їхнього складу (наприклад, у вигляді ТАБ-ефірів), дає інформацію про те, з якого сорту яблук виготовлений цей сік та у якому стані були ці яблука – достатньої зрілості, вражені хворобами чи шкідниками. Залишкі пестицидів, молекули яких містять атоми галогенів, визначають у хроматографі з ДЕЗ, а фосфору або сірки – з ДФП – детектором фотометрії полум’я.

У лабораторії, яка оцінює якість харчових продуктів і визначає вміст добавок і забруднень, можна мати невеликий набір ГХ-колонок, який дає можливість виконати більшість аналізів. У таблиці наведені основні типи фаз і речовини, які можна розділити і визначити на цих фазах. Таблиця 8.1

Тип	Полімерна рідка фаза	Температурні межі, ^0С	Речовини, що визначаються
метил-силікон	OV-1 OV-101 SE-30 DC-200	100-200 20-300 50-350 20-200	Хлор-, та фосфор-органічні пестициди, поліхлордифеніли, карбамати, стероли, тритерпени, N-нітрозаміни, нікотин, ТМС-похідн аліфатичних кислот, цукрів , поліолів, токоферолів…
метил феніл-силікон	OV-17 DC-750	20-300 20-220	Хлорорганічні фуміганти, хлороформ, ТАБ-похідні амінокислот, ТМС-похідні вітамінів А, Д, Е, К та ін.
нітрил-силікон	XE-60	50-250	Хлорорганічні пестициди, карбамати, циклогексиламін…
вуглеводні	Apiezon L Apiezon M	50-270 50-250	Аліфатичні кислоти (метилові естери), альдегіди, лактони…
полі-етилен-гліколь	ПЕГ-1500 ПЕГ-1540 ПЕГ-20М Карбовакс20М	40-120 50-180 80-250	аліфатичні спирти, альдегіди, сульфіди, ефіри, дикетони, N-нітрозаміни, терпени, поліоли…
поліестери	диетиленгліколь-сукцинат, етиленгліколь-адіпат, бутандіол-сукцинат	20-200	метилові, етилові, пропілові та бутилові естери аліфатичних кислот, терпени, ТАБ-ефіри амінокислот, аліфатичні альдегіди…
пористий полімер	Порапак Q	100-200	вуглеводні, оксиди нітрогену, ацетон, гексан, ізопропанол та ін.

Нерухома рідка фаза – це полімер, який у певних температурних межах існує на поверхні твердого носія як рідина, що не випаровується і не потрапляє у детектор. Перевищення цих меж неприпустиме.