Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

cтpyкTypныe белки. Многочисленные и разнообразные белки несут в био­

логических объектах структурные функции.

Эту роль выполняют прежде всего белки, являющиеся компонентами различных биологических мембран, исключая, конечно, те из них, что облада­ ют иной функциональной активностью (мембранносвязанные ферменты, по­ ровые белки, белки переносчики, рецепторные белки и т. п.).

Данные о молекулярных массах структурных белков мембран про­ тиворечивы. У структурных белков митохондрий сердца и печени быка они составляют от 20000 до 60000, а у бактерий- от 1О000 до 160000 Да. Структурные белки мембран отличаются резко выраженной способностью

к агрегации. При рН 12 они существуют в виде мономеров, но при понижении значения рН олигомеризуются с образованием фибриллярных

структур и микрокристаллов. Более	того, они способны соединяться
в стехиометрических соотношениях с	другими белками (например, ми­

оглобином) и особенно с ферментами, характеризующимися мембранной локализацией (цитохромами Сl и Ь, цитохромоксидазой, малатдегидро­ геназой и др.), причем каталитическая активность последних при этом

заметно изменяется. Поэтому полагают, что роль структурных белков

мембран не ограничивается только лишь закреплением ферментов в мем­ бране.

СВQйства структурных белков мембран в определенной мере предопределя­

ются их аминокислотным составом. В них содержатся в высокой пропорции

аминокислоты, обладающие гидрофобными радикаламп (глицин и аланин-

10-15%, валин, лейцин и изолейцин-в среднем 5-6% каждый, а в ряде

случаев-до 9-13%), и сравнительно невелико содержание основных и кис­

лыIx аминокислот. Но самое любопытное состоит в том, что гидрофобные аминокислоты образуют в полипептидной цепи структурных белков мембран

локальные зоны (сегменты), включающие 20 и более остатков только гид­

рофобных аминокислот и занимающие в общем до 20% от длины всей полипептидной цепи. Это способствует возникновению гидрофобных центров

в молекулах структурных белков мембран, в том числе центров, локализован­

ных на поверхности глобулы. Указанное обстоятельство в известной мере

объясняет высокую способность этих белков к агрегации, а также то, что субъединицы в олигомерах связаны силами слабых взаимодействий.

Из аминокислотного состава структурных белков мембран вытекает еще

одно существенное следствие. Содержание в их составе аминокислот, препят­

ствующих спирализации, таково, что доля а-спиральной структуры может составить в среднем 40% полипептидной цепи. Действительно, эксперимен­

тальные данные, полученные методом инфракрасной спектрофотометрии, дис­ персии оптического вращения и кругового дихроизма, убеждают в том, что

значительная часть полипептидной цепочки структурных белков мембран

находится в а-спиральной форме (от 30 до 50%).

Наконец, еще одно специфическое свойство структурных белков мембран

состоит в том, что все они независимо от источника выделения очень охотно

связывают фосфолипиды при нейтральных значениях рН. Так как последние

сохраняют при этом свой заряд, связывание структурных белков мембран

и фосфолипидов идет за счет сил слабых взаимодействий, т. е. при посредстве гидрофобных центров белков и углеводородных радикалов фосфолипидов.

Кроме мембранных белков структурные функции несут белки межклеточ­

ного матрнкса (коллаген, ретикулин), крнст8ЛЛИНЫ, а также белкн ядерного

матрнкса и цитоплазматического скелета. Число последних, частично или

полностью охарактеризованных, достигло сейчас уже нескольких десятков

и это одна из самых острых проблем современной белковой химии.

90

Сократительные белки. Сократительные белки локализованы как в МЬПIIеч­

ных клетках животных, так и в неМЬПIIечных клетках примитивных и высоко­

организованных живых существ. К их числу относятся миксомиозин (нитевид­

ный белок с диаметром молекулы 7,0 нм, выделенный из плазмодия гриба

физарума); белки микротрубочек (диаметр субъединицы в трубочке 4,5- 7,0 нм), обеспечивающих движение протоплазмы в растительных и животных

клетках, миозино- и актомиозиноподобные белки фибриллярного юшарата амебы, ответственные за перетекание ее протоплазмы; белки трубчатых фиб­

рилл, участвующих в движении хромосом в процессе деления клетки; белки центральных и периферических фибрилл жгутиков и ресничек простеЙПIИX,

а также жгутиков сперматозоидов; актин и миозин мышечных волокон.

Кроме контрактильных свойств, подавляющее большинство перечислен­ ных выше сократительных белков обладает аденозинтрифосфатазной актив­

ностью, т. е. соединяет в себе два качества-способность совершать ме­ ханическую работу и ускорять химическую реакцию. Это свойство сокра­

тительных белков было открыто в 1939 г. В. А. Энгельгардтом иМ. Н. Любимовой, которые в октябрьском номере журнала «Nature» (т. 144,

с. 688) опубликовали результаты своих опытов· в статье под названием «Ми­

озин и аденозинтрифосфатаза». Таким образом, эти белки характеризуются

механохимическими свойствами. Общей особенностью, присущей сократи­

тельным белкам, является также то, что их функция зависит от действия

ряда дополнительных белков-активаторов и регуляторов их активности

и от присутствия низкомолекулярных соединений (Mg2 ,Са2+, АДФ). Так,

например, деятельность актомиозинового комплекса МЬПIIц регулируется тро­

помиозином и тропонином.

Конкретные сведения о сократительных белках, выделенных из тех или

иных источников, отличаются различной степенью полноты и достоверности, а в. ряде случаев противоречивы. Наиболее изучены миозин и актив мышц.

Миозин представляет собой волокнистый белок с молекулярной массой 500000 Да, а актин-глобулярный белок с молекулярной массой от 46000 до 58000 Да (рис. 44). Первичная структура фрагмента цепи миозина протяжен­ ностью до 200 аминокислотных остатков, что составляет примерно десятую

часть его полипептидной цепи, выяснена. Удалось расшифровать также пер­ вичную структуру актина из мышц кролика-белка, состоящего из 374 ами­

нокислотных остатков. Актин обладает сильно выраженной способностью

к агрегации, протекающей с образованием надмолекулярных структур в виде суперспирализованных длинных двойных нитей.

О других сократительных белках сведения менее полны. Миксомиозин имеет молекулярную массу около 6000000 Да и размеры молекул 7 х 400500 нм. Сократительный белок из ресничек простейших ближе к миозину

мышц по молекулярной массе (400000), аминокислотному составу и свойст';'

вам. Однако контрактильный белок из фибрилл митотического веретена гло..

булярен (диаметр глобулы от 15 до 20 им, М=880000); дЛЯ него характерна субъединичная структура. 1)тбулин микротрубочек представлен димером с мо.

лекулярной массой 110000 Да.

Выяснение структуры и особенно механизма действия сократительных белков представляет огромный интерес и еще очень далеко от завершения.

Рецепторные белки. Выделение рецепторных белков в особую группу свя.

зано с интенсивным исследованием механизмов передачи информации в био­

лоmческих системах.

Мишенью действия агентов, несущих сигнальные функции, являются ре. цепторные белки, локализованные в мембранном аппарате клетки. Одним

из примеров может служить рецептор ацетилхолина -медиатора передачи

91

	ГOJJовка, СОСТОJIЩЭJI из двух
	субфрагментов с М= 120000
Шейка и фрагмент,примыающийl	жд
	у ка: oro/. "

к хвостовой части, М=60000 ~

I

1-

I-З7НN -1"1 2ОНМ.,'

		1	l'
		I
		,	l'
			,	I
	9з нм	-1-	I
			I	.,
	Хвостовая часть (лencий	Головная часть (ТJlжелый I
	меромиоЗlD!), М.. 150 000	IмеромиоЗlD!). МsЗ4Q 000 I
		I		,

150 им	-1
МиОЗlD!, М=500 000
	6 им
1	п	m

Рис. 44. Схема строения сократительных белков мышц:

l-структура молеlc}'лы миозина. составленной из двух полипептидных цепей, ВКЛ1Очающих около ]800 ами­

но:кислотных остапов UЖД8Ji1. БОЛЬШ8J1 часть молекулы представлена"суперспиралью (горизонтальнаJl часть рисунжа)9 образованной двумя почти полностью спирализоваННЫМИ полипептидIlыии цепями; меНЬШ3J1двумя фрагмекгам& ПQЛИПептидных цепей в глобулярном СОСТOJl.НИИ, где содержание а-спиралей достигает

ЗОо/о (ГОЛОВIC8, ответственная за СВllзывание аrrина и АТФазную активность). Хвостовая часть (легкий

меромиознн) отчленяется от головной части (ТJIJI[елый меромиозии) в результате протеолитического расщеп­ ления трипсином. Thобуmpная часть (головка) отщепл.ется при протеолизе папаином; II-СУllерcrшраль.

составленная из глобул актина. Каждыli шар на рисувхе соответствует МОЛel'уле актииа (м = 46 000); llI-точка прm<penлeнв. головной части молекул миозина (поI<азаны стрелпми) " суперcrшрали аkТИна

в процессе tdЬПllечного СОJ[ращени.о

нервного импульса (см. гл. 111). Он представлен олигомерным белком

(м = 285 000), составленным из пяти субъединиц (сх.2 131~), образующих ионный канал (рис. 45). В отсутствие ацетилхолина этот канал закрыт, но после рецепции секретируемого ацетилх.олина он открывается на короткое время (до

момента разрушения медиатора ацетилхолинэстеразой) и пропускает Na + , что

сопровождается изменением степени поляризации клеточной мембраны и пе­

редачей сигнала через синапс нервной клетки.

Рецепция того или иного вида энергии внешней среды органами чувств, как

показали работы последнего времени, имеет единый механизм, складыва­

ющийся из двух этапов: 1) восприятия энергии стимула рецепторными белка­ мiI; 2) преобразования энергии стимула особыми белковыми молекулами в специфическую информацию и передача ее в центральную нервную систему.

Сведения о рецепторных белках и механизме их взаимодействия с сиг­ налами внешней среды весьма скудны. Представителем фоторецепторных белков является опсин, существующий в виде соединения с ретиналем (родо­ псин) И изменяющий свою конформацию, что связано с преобразрванием

светового сигнала в нервные импульсы в процессе зрительного акта (см.

гл.IV, рис. 60). Из вкусовых рецепторных белков изучен сладкочувствитель­

вый белок (М = 150000). Его аминокислотный состав характеризуется высоким

содержанием дикарбоновых аминокислот и их амидов, лизина, лейцина, вали­

на и пролина. Он способен связывать моносахариды идисахариды. Обонятель-

92

Внешняя

Сl92

Сl93

Внешняя

сторона

ПЛазматическая

мембрана

Внутренняя

сторона

Рис. 45. Структура ацетилхолиновоrо рецептора

в верхнем левом углу- олигомерная форма рецептора; пока.ана пространственна. структура a-<:убъедипицы (М = 40 000), входящей в состав neнтамер~ окружность в центре пентамера-ионный канал диаметром 0,65 им. В нижней части рисунха­ развернута. структура а-<:у.бъединицы рецептора, встроенной в плазматическую мембрану клетки; спиральные участки полипеп­ 'I1Iдной цепи a-<:убъединицы обогащены гидрофобными аминокислотНЫМИ paднJ<аламв, взаимодействующими с остапами высших ""'!'ных кислот фосфолипидноii мембраны; с N-Koнцa полипеП'I1lдные цепи субъединиц глико,илированы и углеводная компонента

В целом составляет примерно 20% массы рецептора; Cl92 и Сl9З-остатlПI цистеина, участвующие в рецепции ацетилхолина

ныii белок выделен из половых сенсилл самцов дубового шелкопряда; он взаимодействует с половым феромоном самок этого насекомого. В восприя­ mи звуковых колебаний и их преобразовании в нервные импульсы придают

большое значение холинорецепторным белкам, которые, как показано недав­

но, ответственны за проницаемость клеточной мембраны.

Большие перспективы открываются при изучении рецепторных белков

насекомых, особенно тех, которые осуществляют рецепцию аттрактантов

и репеллентов.

Белки-ингибиторы ферментов. Вещества белковой природы составляют самую многочисленную группу ингибиторов ферментов, причем наиболее изучены из ее состава белки, ингибирующие активность протеаз. Белковые инmбиторы образуют с протеолитическими ферментами стойкие при физио­ лоmческих условиях комплексы, в составе которых фермент полностью или

чаcmчно теряет свою активность. Так как константы диссоциации этих ком­

плексов лежат в пределах 10-12-10-9 моль, они действительно отличаются

высокой прочностью, а ингибиторы, входящие в их состав,- большой мощ­

ностью действия.

Выделено и изучено несколько десятков белковых инmбиторов, подав­

ляющих активность трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, калликре­

ина, эластазы, плазмина и дру~их протеолиmческих ферментов. MHome из

них получены в гомогенном кристаллическом состоянии. Молекулярные мас­

сы инmбиторов белковой природы колеблются от нескольких тысяч до не­

скольких сотен тысяч, но в основном они представлены белками с моле­

кулярными массами около 6000 Да. MHome из белков-ингибиторов фер­

ментов-являются гликопротеинами. Первичная структура нескольких

93

десятков ингибиторов расшифрована; среди них-ингибиторы трипсина 1 и Il из поджелудочной железы свиньи и быка, соевых бобов, арахиса и фасоли,

ингибиторы протеиназ из яда гадюки, лимских бобов и ананаса, ингибитор

химотрипсина из картофеля, инактиватор калликреина (тразилол) из легких быка, ингибитор субтилизина из стрептомицета и др.

БеJIЮI вирусных оболочек. Из многочисленных вирусов выделены и изучены

разнообразные белки. Их молекулярные массы колеблются от нескольких

тысяч до нескольких десятков тысяч дальтон. Наряду с основной функцией

(защита нуклеиновой кислоты) некоторые белки вирусных оболочек необ­

ходимы для созревания вирусных частиц, обладают ферментативной актив­ ностью (нейраминидаза, лизоцим и обратная транскриптаза в составе ряда

вирусов) и др.

Первичная структура белковых субъединиц многих вирусов выяснена. К их числу относятся субъединицы трех штаммов вируса табачной мозаики

(159 аминокислотных остатков), субъединицы бактериофаговfг иf2 (129 оста­

тков), бактериофага Qp (131 остаток), бактериофага ZI (50 остатков), субъеди­ ницы вируса желтой мозаики турнепса (190 остатков) и вируса ядерного полиедроза тутового щелкопряда (244 остатка), субъединицы бактериофага fd

(50 остатков), а также ряд белков вируса гриппа (гемагглютинин- 566

и PV2-759 аминокислотных остатков).

Удивительной особенностью вирусных белков является их способность

к агрегации, вследствие чего даже в отсутствие вирусных нуклеиновых кислот

они способны к самосборке в соответствующие, характерные для данного вируса морфологические структуры (тени вирусов и фагов). Кроме того, их

структура такова, что концевые аминокислоты, как правило, маскированы

в глубине молекулы и труднодоступны для определения.

БеJIЮI с ИНЫМИ функциями. Несомненно, что и далее из крайне многочислен­

ных конкретных представителей класса белков могут вычленяться новые

группы с ясно выраженной функциональной активностью и связанной с нею

спецификой структуры и свойств. Так, например, уже сейчас обособляются группа гемоглобинов, группа фибриллярных белков, группа рибосомальных белков и др. Это лишь подтверждает высказанное ВЬПIIе мнение о том, что классификация белков переживает сейчас период становления.

ГЛАВАIII

ФЕРМЕНТЫ

ОБЩЕЕ ПОНЯТИЕ О ФЕРМЕНТАХ

Важнейшим свойством ряда белков, как уже отмечено, является их катали­

тическая активность, теснейшим образом связанная с общими особеииостRМИ

их структуры.

Каталитически активные белкя: Называют ферментами (от лат.fеrmеntum­

закваска) или эцзимами (ог греч. ен-внутри, зuм-закваска). Как вытекает

из происхождения названий этих веществ, первые сведения об их существова­ нии были получены при изучении процессов брожения.

Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганиз­

мов колоссальна. Благодаря каталитической функции разнообразные фермен­

ты обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций. Складываясь в единый ансамбль саморегулиру­ емых биохимических процессов, эти реакции преобразования веществ состав­

ляют материальную и энергетическую основу непрерывного самообновления белковых тел, т. е. самой сущности жизненных явлений. Поэтому ферменты «есть возбудители всех химических превращений» (И. П. Павлов), TpaHC~­

торы (т. е. датчики) в регуляции обмена веществ.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Подсчитано, что живая клетка может содержать до 1000 различных фермен­

тов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию.

Биологические катализаторы (ферменты) по ряду признаков резко отличаются

от неорганических катализаторов, хотя те и другие лишь ускоряют достижение

равновесия в химических процессах, которые протекают сами по себе, но с очень малыми скоростями. Как и катализаторы неорганической природы, биокатализа­ торы не вызывают каких-либо химических реакций, а лишь ускоряют существую­

щие. Первое различие состоит в том, что по сравнению с катализаторами

неорганической природы ферменты «работают» в очень МJПЮIX условlUIX (низкая температура, нормальное давление, невысокие значения рН среды и т. п.) И очень

интенсивно. Так, например, гидролитический распад белка до аминокислот

в присутствии неорганических катализаторов (крепких кислот или щелочей) осуществляется при температуре 1000 С и выше за несколько десятков часов. Эrот же процесс при каталитическом участии специфических ферментов протекает за

десятки ми"YI: при температуре 30-400 С. Для гидролиза крахмала, как

указывал еще Й. Берцелиус (1836), при нагревании в растворе кислоты нужно

несколько часов, а при участии соответствующего фермента этот процесс идет при

комнатной температуре всего несколько минут. Ионы Fe каталитически ускоряют

разложение Н2О2 на Н2О и 02' Однако атомы того же Fe, но в составе фермента каталазы действуют в 10 млрд. раз энергичнее, и всего 1 мг Fe в ферменте

способен заменить в этой реакции 10 т неорганического Fe. Таким образом,

9S

ИСКJПOчительно высокая каталитическая активность, проявляемая в условиях

нормальной температуры и давления, отличает биокатализаторы от неор­

ганических катализаторов.

Второе различие заключается в том, что ферменты обладают необыкновен­

но высокой специфичностью действия, чего не наблюдается у катализаторов

неорганической природы. Каждый фермент каталитически ускоряет, как пра­

вило, одну-единственную химическую реакцию или в крайнем случае группу

реаКций одного типа.

Наконец, ряд различий между биокатализаторами и неорганическими ка­

тализаторами связан с белковой природой ферментов. Сюда относятся термо­

лабильность, зависимость активности от рН среды и наличяя активаторов или

ингибиторов и др.

Самая существенная разнИца между ферментами и обычными катализатора­

~ вскрыта лишь в последние годы. Она состоит в том, что благодаря

уникальной структуре каждого фермента процесс ферментативного катализа

предстает перед нами как серия элементарных превращений вещества, строжай­

шим образом организованных в пространстве и времени. Кооперативность

и жесткая запрограммированность этапов действия-вот что отличает меха­

низм биокатализа от действия катализаторов иной природы, хотя это не

исключает некоторой степени вариабельности как структуры самого фермента, ·так и строения промежуточных продуктов в процессе ферментативного катализа.

В природе под каталитическим воздействием ферментов осуществляются

процессы гидролиза, фосфоролиза, переноса различных групп (метильные

радикалы, остатки фосфорной кислоты и т. д.), окисления и восстановления,

расщепления и синтеза, изомеризации и т. п. Практически все химические

преобразования в живом веществе протекают с помощью ферментов. Естествен­

но поэтому, что каталитическая функция ферментов лежит в основе жизнедея­

тельности любого организма. При посредстве ферментов реализуется влияние

как внутренних, генетических, так и внешних, природных факторов на развитие организма. Благодаря контакту ферментов с лекарственными веществами и антибиотиками достигается такое изменение ферментативных процессов,

котороеспособствует излеченшо от болезней, в то же время изменение фермента­ тивной активности под влиянием микробных токсинов и иных ядов ведет к mбели организма. Стимуляция роста животныхи растений разнообразными препарата­

ми, применяемыми в сельском хозяйстве, в большинстве случаев основана на их

воздействии на процесс биосинтеза или активность тех или иных ферментов.

Тончайшиеразличиястроения ряда ферментов определяют видовые особенности

организмов, а в нарушении биосинтеза некоторых из них заложена причина

возникновения наследственных идругих заболеваний. Все это свидетельствует об

огромном значеmш ферментов для биологии, сельского хозяйства и медицины.

Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности

осуществлять каталитическую функцию. На этом основано их практическое

применение в химической, пищевой, легкой и фармацевтической промыш­

ленности. Особое значение для химического производства имеет специфич­

ность ферментов: ведь до 80% затрат в производстве многих химических

веществ приходится на отделение примесей, возникших в результате побочных

реакций. Проведение синтеза при посредстве высокоспецифичного фермента,

ускоряющего только ту реакцию, которая ведет к образованию нужного

продукта, упрощает технологический процесс. Кроме того, ферменты позволя­ жот осуществлять ряд процессов, выполнение которых обычными методами

органического синтеза остается пока нерешенной проблемоЙ. Так обстоит

дело, например, при получении лекарственных препаратов путем фермента­

тивной трансформации стероидов.

96

мETQдыI ВЫДЕЛЕНИЯ И очистки ФЕРМЕЮОВ

Долгое время вполне, обоснованно считали, что все ферменты-тела бел­ ковой природы. Однако в начале 80-х годов была неожиданно открыта способ­ ность низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот ускорять реакцию превра­

щения предшественников РНК в функционально значимый продукт, т. е.

возникло представление о полнрибонуклеотИДIIОЙ природе некоторых фермен­

тов, названных рибозимами (см. гл. VI).

Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов-рибонукле­

азы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома С, трудно ожидать, что синтетиче­ ское получение ферментов получит UШffPокое распространение в ближаЙ1Uие

десятилетия ввиду его сложности и дороговизны. Поэтому единственный

реальный в настоящее время способ получения ферментов- это выделение их из биологических объектов.

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экс­ тракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а· также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждеmш и быстром

обезвоживании при температуре не ВЬШlе -100 С тканей или вытяжек из НИХ,

содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов

путем адсорбции ~ Dо~едующей ЭJПOцией (снятием) с адсорбента. Этот метод

был введен в химию ферментов А. я. Данилевским и дал мощный толчок

развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод

1I0нообменной хроматографиu, метод молекулярных сит, электрофорез и осо­

бенно uзоэлектрофокусирование. Одна из остроумнейших модификаций ад­

сорбционного метода-аффинная хромamографuя, где адсорбентом служит

вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате

лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему

выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый

фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одвоэтапную (аффинная сорб­

ция-элюция) схему выделения.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необ­

ходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разруше­

ния субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут

в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведеншо всех операций в условиях, ис­ ключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей фермен­

тативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии

защитных добавок, в частности НS-содержащих соединений (цистеина, глута­

тиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.):

HS-CH2 -CH2 -NH2	HS-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH
Цистеамви .	Дв11IОТРСИТОJl

Очень важно подцерживать на всех этапах выделеНШI ферментов низкую

температуру, так как некоторые из них даже при - 800 С теряют активноСТЬ.

Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к оБычныIM методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствоваmш

методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов

было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в 1906 г. А. д. Розенфельдом (им была получена в виде кристаллов оксидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую известность после работы

4-3502	97

Д. Самнера по получению кристаллической уреазы из бобов канавалии. Нере-,

ДКО о степени чистоты ферментного препарата судят по его биологическоii.

активности; если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат

можно считать гомогенным. Из 2003 включенных в список ферментов более

1500 выделено и в той или иной мере очищено, третья часть их закристалли­

зована, у нескольких сотен выяснена первичная, а у нескольких десятков­ третичная структура.

СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

ПО строению ферменты могут быть однокомпонентными, простымИ бел­

ками, и двухкомпонентными, сложными белками. Во втором случае в составе фермента обнаруживается добавочная группа небелковой природы.

В разное время возникли различные наименования белковой части и доба­ вочной группы в двухкомпонентных ферментах. Все они до сих пор употребля­

ются в литературе, например:

Фермент IJ целом	Белковая часть	)fобавочная группа
Симплекс	Ферон (носитель)	Агон (активная группа)
Холофермевт	Anофермент	Кофермент

Добавочную группу, прочно связанную, не отделяемую от белковой части, называют простетичесКОЙ ГРУППОЙ; в отличие от этого добавочную группу, легко отделяющуюся от апофермента и способную к самостоятельному су­

ществованию, обычно именуют коферментом.

Химическая природа важнейших коферментов была выяснена в 30-е годы

нашего столетия благодаря трудам о. Варбурга, Р. Куна, п. Каррера и др. Оказалось, что роль коферментов в двухкомпонентных ферментах играют большинство витаминов (Е, К, Q, В1, В2, Вб, В12, С, Н И др.) или соединений,

построенных с участием витаминов (коэнзим А, НАД+ И т. п.). Формулы

упомянутых коферментов приведены в гл. IV. Кроме того, функцию кофер­ ментов выполняют такие соединения, как НS-глутатион, многочисленная группа нуклеотидов и их производных, фосфорные эфиры некоторых моноса­

харидов и ряд других веществ.

Характерной особенностью двухкомпонентных ферментов является' то, что ни белковая часть, ни добавочная группа в отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическую активность доба­ вочной группы, присущую ей в свободном состоянии в очень малой степени; добавочная же группа стабилизирует белковую часть и делает ее менее уязви­

мой к денатурирующим агентам. Таким образом, хотя непосредственным

исполнителем каталитической функции является простетическая группа, об­

разующая каталитический центр, ее действие немыслимо без участия полипеп­

тидных фрагментов белковой части фермента. Более того, в апоферменте есть

участок, характеризуюIЦИЙСЯ специфической структурой, избирательно свя­ зывающий кофермент. Это так называемый кофермент связывающий домен;

его структура у различных апоферментов, соединяющихся с одним и тем же коферментом, очень сходна. ThKODbl, например, пространственные структуры

нуклеотидсвязываюЩИХ доменов ряда дегидрогеназ (см. рис. 53, с. 119).

Иначе обстоит дело у однокомпонентных ферментов, не имеющих доба­

вочной группы, которая могла бы входить в непосредственный контакт с пре­

образуемым соединением. Эту функцию выполняет часть белковой молекулы,

называемая каТ8JIИlическвм центром. Предполагают, что каталитический

центр однокомпонентного фермента представляет собой уникальное сочета­

ние нескольких аминокислотных остатков, располагающихся в определенной

части белковой молекулы. Сказанное иллюстрирует рис. 34, Г, на котором

приведена третичная структура химотрипсиногенапредшественника одно­

компонентного фермента: аминокислотные радикалы остатка сер и двух оста­

тков гuс, расположенные в разных ТОЧJ:ах полипептидной цепи, сблизились

здесь на расстовние в несколько десятых долей нанометра, предобразовав

каталитический центр фермента. На этом же рисунке (Б и В) приведена

третичная структура молекул еще двух ферментов-лизоцима и рибонуклеа­

зы; у них ясно просматривается двухъядерная, двухлопастная конструкция

молекул с углублением (щелью) на границе двух лопастей, в котором распола-

гается каталитический центр.

.

Чаще всего в каталитических центрах однокомпонентных ферментов встре­

чаются остатки сер, гuс, три, арг, цис, аcn, глу и тир. Радикалы перечисленных

аминокислот выполняют здесь ту же фушцию, что и кофермент в составе

двухкомпонентного фермента.

Аминокислотные остатки, образующие каталитический центр одноком­ понентного фермента, расположены в различных точках единой полипептид­

ной цепи (см. рис. 34). Поэтому каталитический центр возникает в тот момент,

когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру.

Следовательно, изменение третичной структуры фермента под влиянием тех

или иных факторов может привести к деформации каталитического центра и изменению ферментативной активности.

Кроме каталитического центра, образованного сочетанием аминокислот­ ных радикалов или присоединением кофермента, у ферментов различают еще

два центра: субстратный и 8JШостеричесшй (см. ниже, рис. 51).

Под субстратным центром понимают участок молекулы фермента, ответ­

ственный за присоединение вещества (субстрата), подвергающегося фермента­

тивному превращению. Часто этот участок называют «якорной площадкой» фермента, где, как судно на якорь, стаНоВИТСJl субстрат. Во многих случаях

прикрепление субстрата к ферменту идет за счет взаимодействия с Е-амино­ группой радикала лиз, расположенного в субстратном центре. Эту же роль

может выполнять СООН-группа гду, а также НS-группа цис. Однако работы последних лет показали, что гораздо большее значение здесь имеют силы гидрофобных взаимодействий и водородные связи, возникающие между ради­

калами аминокислотных остатков субстратного центра фермента и соответст­

вующими группировками в молекуле субстрата.

Понятие о каталитическом и субстратном центре не следует абсолютизиро­ вать. В реальных ферментах субстратный центр может совпадать (или пере­

крываться) с каталитическим центром. Более того, каталитический центр

может окончательно сформироваться в момент присоединения субстрата. Поэ­

тому часто говорят об активном центре фермента, представляющем сочетание первого и второго. Активный центр у ферментов располагается на дне щели

при двухъядерной структуре, например у лизоцима и рибонуклеазы, или на

дне глубокой впадины, как у химотрипсиногена (см. рис. 34). Аллостерический центр представляет участок молекулы фермента, в ре­

зультате присоединения к которому определенного низкомолекулярного (а

иногда-и высокомолекулярного) вещества изменяется третичная структура

белковой молекулы. Как следствие этого изменяется конфигурация активного

центра, сопровождающаяся либо увеличением, либо снижением каталитиче­

ской активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой

8JIJIостерической регуляцин каталитической активности ферментов.

99