Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

1	л·	ш-	IY	у
•••	•••		000
•••	•••	•••	D D D

000	••• ••• • ••
000	•••• ••

о о о - ионы исходного 611фера

••• - UQHbI nРОR~umеЛR

::: }-rpракцuонuрgе,.,ые 6елкu

0-uоноо6мвннuк

Рис. 10. Мехави:'М ионообменной хроматоrрафии белков

Механизм ИOllOобмеввой хроматоrpафии СВОДИТСJl

k вытесйению противоиопов, связанных с анионны...

ми в катионными центрами ионообменииха (1) ВО­ HoreRRblMB rpуппиров"ами белковых молекул (/1)

н связыванием последних с ионообмеНВIIXОМ за счет

электростатического взаимодействия. В зависимо­ СТИ от вида белка и особенно от соотвоmеВИJI в его

составе радикалов rлавным образом днхарбоновых

аМIIНОКИСЛОТ и диамивоl<ВСЛОТ суммарный эффект этих связей варьирует, вследствие чего разные белки с неодинаковой СКОРОСТЬЮ вытесНЮОТС8 (: иоио06меНJlИI(а ионами проивителя (11/ в /11) в выходит из колоИI<В раздельно. Затем ионообмеввп регениру-

ют (11)

полненную адсорбентом. В качестве адсорбента применяют производные целлюлозы и сефадекса (см. с.325), несущие ионообменные группировки (аминоэтильные, сульфоэтильные, карбоксиметильные и др.), гель фосфата

кальция, силикагель и другие носители. В тех случаях, когда носители из­ бирательно связывают строго определенные белки, фракционирование бел­

ковых смесей идет очень эффективно. Такой вид хроматографии называют хроматографией сродства или аффивной хроматографиеЙ. За последние 5 лет IIIИрокое распространение получила металлохелат аффинная хроматография белков, основанная на их способности обратимо сорбироваться на иммо­

БИЛИЗОВalШЫХ ионах переходных металлов, используя свободные коорди­

национные связи последllИX.

Одной из ее модификаций является хроматография, основанная на гид­

рофобном взаимодействии носителя (фенилили октилсефароза) с соответст­

вующими неполярными аминокислотными радикалами белковых молекул..

Применение эффективных сорбентов (разл.ичные ПРОИЗ80дные силикагеля)

и высокого давлеIЩЯ при элюировании с них белков привело к возникновению

ряда вариантов жидкостной хроматографии высокого разрешения. Механизм ионообменной хроматографии белков представлен на рис. 10.

Для элюции адсорбированных белков с колонки используют солевые рас­ творы, имеющие различные концентрации и значения рН. Если изменение концентрации солевого раствора осуществляется в процессе снятия белков

с одной и той же колонки, такую элюцию называют градиентной. Элюат

собирают небольшими порциями (по несколько миллилитров) в отдельные

пробирки при помощи специальной установки-коллектора (сборщика) фрак­

ций. Таких проб в процессе фракционирования белков на колонке хроматогра­

фическим методом получают обычно несколько сотен. В результате проведе­ ния цветной реакции на белок или путем измереЮlЯ поглощения каждого раствора в ультрафиолетовой области спектра устанавливают содержание

белка в каждой пробе. По этим данным строят кривую, из рассмотрения

которой становится ясным, сколько фракций белка содержится в элюате

и в Itакой серии пробирок находится каждая фракция. Одноименные пробы

объединяют и из полученного раствора выделяют чистый белок. ~акционироваЮlе белков методом молекулярных сит основано на раз­

личной скорости перемещения белковых молекул (в зависимости от молеку­

лярной массы) через колонку, заполненную специальным материалом-сефа­

дексом'. Сефадекс получают путем обработки эпихлоргидрином полисахарида

I Его название образовано из начальных слогов трех слов; separation (разделение), phurmacia_ (название шведской фирмы, выпускающей реактивы) и dextran (декстран). П-рименяют такжеС

30

декстрана, в результате чего между молекулами последнего возникает то или

иное число поперечных связей:

в цепь

к 3-му уrлеродиому атому ос1атка rлЮКСШd ~ОС8ДН8Й цепи декстрана

н

f

к 3-му уrлеродиому атому ~TaTKa rлioКОЗ.1 соtеДИ8Й цепи декстрана

t">" О"

К 3-МУ уrлеродиому атому

опаткв rлюкозы соседней цели

декпрана

Аналогично этому обработка другого полисахарида-агарозы 2,З-ди­

бром-пропанолом в резко щелочных условиях приводит к возltикновению сетчатого полимера сефарозы, дающего гели, пригодные для фракционирова­ ния белков с молекулярными массами в сотни Тысяч дальтон.

В зависимости от числа поперечных связей в сефадексе и размера белковых

молекул осуществляется та или иная степень проникновения последних внутрь

гранул сефадекса, заПОJIНЯЮЩИХ колонку. Большие белковые молекулы, не

способные пройти через сито из ячеек в гранулу, быстро выносятся ИЗ колонки

с током элюента; мелкие молекулы белка, проникшие внутрь зерна сефадекса,

удерживаются некоторое время последним и выходят из колонки с последу­

ющими порциями элюата. Таким образом, колонка с сефадексом как бы

просеивает через себя молекулы белка по их размерам, выпуская, как это ни

парадоксально, первыми самые крупные молекулы (рис. 11). Так как гранулы

сефадекса сильно разбухают в растворителе и образуют гель, этот метоД

называют также метоДОМ гельфильтрации.

Интересен предложенный п. А. Альбертсоном метод фракционировании

белков с помощью двухфазных систем, составленных из водных растворов

полимеров. при этом способе фракционирование осуществляется в мягких условиях (физиологические значения ионной силы и рН среды), а водные

растворы полимеров оказывают стабилизирующее действие на разделяемые

белки. Метод позволяет работать с любыми количествами вещества,

аналогичные сефадексу материaлымолселектT (сефадеltс фирмы «Реанал», Венrрйя), акрилекс и биогель Р (на базе полиакриламида), сефакрил (ПОlIучают из аллилдекстрана и N, N'-метилен­ бисакриламида), сефарозу (получают из агарозы) и др. ПеречислеННblе материалы НШ1IJIи широкое применение не только для фракционирования белков, но и для разделения нуклеиновых кислот, высших углеводов и других биополимеров (см. также с. 325).

31

Рис. 11. Механизм разделения веществ по молекулярной массе на колонке с сефадексом:

А-колонка в начале работы: светлые кружки-зерна сефaдeJcCВ:

темные ТОЧlCи-молекулы белков разной молекулярной массы, TOJJ!oo IЮ что внесенные в верхнюю часть ](оловхи; Б-по мере продвих:ени. проявнтеля по "олоmе (сверху вннз) осущестВЛjlется пер"нос молекул белков. однако только меньщие молео:улы белков ПРОНИl<ают внутрь зерен сефадекса; В-мелкие молекулы бeлJ<ОВ резко отстают от круп­ ных его молекул. задерживаясь в зернах сефадекса. Первыми из

колонки ВЫЙДУТ большие молекулы

А

6

8

используя простейшую аппаратуру. Распределение белков между фазами опре­ деляется различиями в физико-химических свойствах фракционируемых белков

и полимеров, входящих в состав верхней и нижней фаз: на основе комплекса свойств тех и других происходят взаимодействия (образование ионных и водо­ родных связей, гидрофобные взаимодействия и др.), приводящие к накоплению

определенного белка или группы белков в одной из полимерных фаз.

ОЧИСТКА БЕЛКОВ

Белки, выделенные ОJ1исанными способами, всегда содержат, некоторое

количество низкомолекулярных примесей, особенно ионов солей. Для полного

освобождения от этих примесей белки подвергают дальнейшей очистке путем

диализа, электродиализа, ультрафильтрации и перекристаллизации, гельфиль­

трации и другими способами.

Очистка белков методом диализа состоит в длительном, в течение несколь­

ких суток, пропускании воды через сосуд, в который погружен диализацион­

ный мешочек. Его готовят из материалов, хорошо проницаемых для низ­

комолекулярных соединений и ионов, но не пропускающих крупных молекул

белка. Материалом для полупроницаемых мембран служит целлофан, размер

пор которого можно изменять в широких пределах обработкой раствором

ZnCI 2 • Внутрь диализационного мешочка (камеры) помещают раствор белка.

Камеру, как правило, снабжаю~ капиллярной трубкой. В нее в первые часы

диализа устремляется часть белкового раствора, объем которого возрастает вследствие поступления воды внутрь камеры (рис. 12./).

Даже после длительной очистки белка путем диализа в нем остается

некоторое количество ионов, сорбированных. белковыми частицами. Для полного удаления загрязняющих белок ионов используют метод электро­

диализа: возле полупроницаемых мембран диализационной камеры поме-

1

Рис. 12. Установки для очистки бел­ ка путем диализа (1) и электродиализа (11):

J-трубка для подведения воды; 2-корпус

		диализатора;		3 - диа..·lИзнционныЙ·	мешочек;
		4 -трубка для отвода воды и регулирования ее
		уровня; 5-	канн)],яриая трубка; А -		днвлиза­
	II	ционная камера; Б-корпус эле"тродиалиэато­
		ра; а и	а1 -	ПО..r1упроницаемые мембраны;

(j и б1 -электроды; стрелками указано направ-

ление движеНИJil воды

32

щают электроды, на которые подают напряжение, в результате чего остатки ионов

поступают в омывающую мембраны воду и выносятся из аппарата (рис. 12.//).

Полупроницаемые мембраны высокой прочности из нецеллюлозных мате­ риалов с калиброванными порами, через которые проходят низкомолекуляр­ ные вещества; но не проникают высокомолекулярные белки, используют для очистки белков методом ультрафильтрации. Белковый раствор 'продавливают через такую мембрану сжатым газом или центробежной силой. Белок, оста­ ющийся в процессе ультрафильтрации на мембране, не только очищается от низкомолекулярных соединений и ионов, но и концентрируется. Если подоб­ рать такой размер пор в мембране, что через них будут проходить не очень крупные белки, а большие белковые молекулы будут задерживаться, то уль­

трафилътрация может служить для фракционирования'белков.

Долгое время считали, что белковые вещества существуют только в аморф­ ном состоянии. Однако в 1906 г. наш соотечественник А. д. Розенфельд впер­

вые закристаллизовал оксидазу, выделt)нную из редьки, а в 1926 г. американ­

ский ученый Д. Самнер получил другой кристаллический белок-фермент уреазу (от лат. urеа-мочевина). Затем в течение последующих лет были

получены в кристаллическом состоянии десятки белков.

В настоящее время доказано, что любой белок может существовать в кристал­ лической форме. В основе различных приемов кристаллизации белка лежит

принцип очень медленного приближения к той критической точке, в которой белок из растворенного состояния переходит в осадок. В этом случае белковые молекулыI успевают закономерным путем объединиться в надмолекулярныIe агрегаты и дают кристаллические структуры. Практически такое медленное осаждение белков достигается путем введения соли через полупроницаемуlO мембрану или при

медленном испарении воды из содержащего соль белкового раствора вплоть до точки высаливания. В последнее время получила распространение кристаллизация

белков с использованием орга-

нических соединений: 2-метил-

2,4-nентадиола и полиэтилен-

гликоля; с их помощью удалось

закристаллизовать ряд белков,

не поддававшихся этому тради-

ционнымиметодами.

Несколько видов белковых

кристаллов	приведено	на
рис. 1З. Кристаллические		бел-

ки, .особенно полученные в ре-

.

~~tv~
/а ~ ~ ~') ~....
;) "C1~~fr ~
~.'	.•~ь.I ~,
t~,.. ~	i:I'"dJ ('~
;,;'; ~'. ~ .~..
. -«' ..l	' ., • _ \.

". ,О '. АО""""- ~,.

I~~) ~':,...6>

зультате перекристаллизации,

А

б

отличаются высокой степенью

чистоты.

Хорошие результаты дает
очистка белков от низкомо­
лекулярных примесей при по­
мощи гельфильтрации. Зерна се­
фадекса достаточно долго удер­
живают низкомолекулярныIe ве­
щества, и белковая фракция
успевает за это время выйти из
колонки в чистом виде. Фильт­
рацию через гель сефадекса ши­	8	·Г
роко используют для обессоли­	Рис. 13. Виды белковых кристаллов: химотрипсина (А),
вания белковых растворов.	пепсина (Б), белка дрожжей (В), рибонуклеазы (1)

2-3502

зз

/ --------

-~~:-I:~-'::-=-~+-I:--

Рис. 14. Оценка гомогеиности белка

по независимости растворимости

от количества твердой фазы:

сплошиой линией пшса:t3Н ход кривой в случае rOMorCHHoro белка. пунлиром-при Н8JlНЧИИ

примеси

ОЦЕНКА ГОМОГЕННОcrи БЕЛКА

Вопрос о том, является ли полученный бел­

ковый препарат индивидуальным белком .или смесью белков, имеет важнейшее значение. Так

как белки выеляI9тT из биологических объектов,

содержащих тысячи и десятки тысяч индивиду­

альных белков (экспериментально в клетках эукариот доказано наличие более 1200 отдель·

ных белков, но теоретически их число прибли.

жается к 10000), всегда можно ожидать, что

в составе изолированного белка есть примесь других белков; это может привести к непра­

вильным заключениям и выводам о свойствах исследуемого белка. Поэтому в белковой хи­

мии большое внимание уделяют оценке гомоген­

ности, т. е. однородности белков.

Для этого предложено почти полтора десятка

методов. Белок признают гомогенным, если увеличение его количества в твер­

дой фазе не сопровождается возрастанием содержания белка в растворе (рис. 14). Наличие одной белковой полосы при электрофорезе в полиакрила·

МИДНОМ геле, одного пика на выходной кривой (либо одной белковой зоны на

пластинке) при хроматографировании или гельфилътрации, резкой границы пограничного слоя белок-растворитель при улътрацентрифугировании бел­ ка являются наиболее надежными показателями гомогенности белкового пре­ парата. В большинстве случаев гомогенны кристаллические белки. Если кри·

вая распределения белковых частиц по высоте при использовании метода

свободной диффузии подчиняется теоретической кривой распределения Гаусса,

белок гомогенен. Достижение в процессе очистки белка стабильного coдep~a­ ния свободных НS-групп или содержания радиоактивной метки (при работе

с меченым белком), равно как и постоянного уровня биологической (ферме~­ тативной, гормональной и т. п.) активности, свидетельствует в пользу гомо­

генности белка. Выявление единственной N-концевой и единственной С·кон­

цевой аминокислоты при анализе белкового препарата также является призна­ ком гомогенности выделенного белка.

Работами последних лет доказано, что каждый индивидуальный белок

состоит из молекул только одного вида, строго одинаковой молекулярной MaCCbJ,

состава и строения. Поэтому столь важно получить гомогенный препарат белка.

I

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА БЕЛКОВ

Молекулярную массу белка измеряют различными физическими методами:

гравиметрическим, вискозометрическим, осмометрическим, ультрафильтраци­

онным, гельфильтрационным, электрофоретическим, оптическим. Полученную

величину принято называть физическим значением молекулярной массы белка;

она определяется с точностью в несколько сотен, а иногда и тысяч дальтон.

у многих белков в настоящее время выяснена первичная структура, что дает возможность рассчитать молекулярную массу с точностью до сотых долей дальтона, т. е. получить химическое значение молекулярной массы белка.

. Обычно оперируют значениями физических молекулярных масс белков, варьиру­ ющих для всего спектра природных белков в очень широких пределах (табл. 3).

34

Тl16л.иц а 3

МолеКУЛllpиаи масса, степень 8С:ИММeтpRИ молекул 11 и]О:)лектрические ТОЧКИ иекоторых белков

		Молекул.рнаи	Степень	И30ЭJJСКТРНЧCICIU
	БеЛОI		асимметрии
		масса		точка
			моле"улы

Миогло8ин кашалота	17600	3,0	7,0
Пепсин	35000	4,0	1,1
Альбумин JЩЧИЫЙ	46000	4,4	4,6
Ieмоглобин лошади	68000	4,3	6.6
'Y-IЛобулин человека	160000	6,0	7,3
Каталаза	250000	5,8	6,7
Фибриноген человека	450000	17,5	5,4
Уреаза	483000	4,3	4,9
Тиреоглобулин СВШIЬи	630000	9,2	4,5
Антипневмококковый сывороточный глобулин	920000	20,1	4,4
лошади
Iёмоцианин улитки		4,8	4,7
	6600000

Определение молекулярной массы белка гравиметрическим методом ве­ дут в аналиmческих улътрацентрифугах (рис. 15). Принцип количественно­ го изучения размеров взвешенных частиц в центробежном поле А. В. Думан­

ский выдвинул еще в 1913 г.,

ион же пытался определить

размеры частиц по скорости

оседания в обычных лабора­

торНых центрифугах. Однако первая ультрацентрифуга с оп­ тической приставкой, позволяю­

щей наблюдать и фотографиро­

вать процесс седиментации (осе­

дания) частиц, была построена

шведским физико-химиком Т. Сведбергом десятью годами позже. При вращении ее ротора развивалось центробежное уско­

рение, превышающее ускорение

силы тяжести всего в 150 раз.

В современных типовых улътрацентрифугах это пре­

вышение достигает 300000,

Рис. 15. Устройство улътрацентрифуги:

1 и 2 - верхняи И нижням стальные плнты; з­ creнxa ствльпоrо цилиндра; 4-стальнаJl игла с ПОП­ ВfшеНllЫ1d ротором (11); 5-праеод ротора; 6 - термопара; 7-мQИТа.жнаи плита; 8-злектромаr­

IlИТIIЬLЙ 38твор; lI-мсталJIIIЧе\:киli патруБОК. weди­

нlIЮIIIIIЙ вaJ<уумную камеру ~ фотоаrJПаратом; 10, Н-верхнее в 6И""'ее кварцевые охиа; 12-сталь­

HolI XllQCТORJQ[ ротора в направляющей ВТУЛI<С; 14- гнездо ротора для ичеllки. в которой наблюдают оседаllие белковых частиц

35

а в специализированных- 900 000-1200 000. Данную величину называют

ОТНОСитeJlЬным центробежным ускорением или фактором разделения: Фр=ro2r/g,

где ro-угловая скорость ротора, рад/с; r-·-расстояние от центра ротора до

середины ячейки с раствором белка, см; g-ускорение силы тяжести, см/с2•

Таким образом, например, запись 100000 g означает, что центробежное уско­ рение в месте расположения ячейки в роторе ультрацентрифуги превышает

ускорение силы тяжести в 100000 раз. Величина достигаемого в ультрацент­

рифуге фактора разделения- одна из важнейших ее характеристик. Исследуемый раствор белка помещают внебольшую прозрачную для

световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора.

Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развива­ емой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприс:rавка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через опре­ деленные промежутки времени и определять таким образом скорость оседа­ ния белковых частиц. Определение молекулярной массы белка методом уль­

трацентрифугирования ведут двумя способами: по скорости седиментации белковых молекул и по седиментационному равновесию.

В первом случае измеряют скорость перемещения в ячейке ультрацент­ рифуги границы растворитель-белок, относя ее к величине развиваемого

центробежного ускорения,.т. е. находят константу седиментации: s = v/ ro2r, где v-скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с, ro2r-центро­

бежное ускорение, см/с2• Размерность s выражают в секундах. Величина

константы седиментации, равная 1О-13 с, принята за единицу и названа све­

дбергом (S, или Св). Вводя значение экспериментально найденной константы

седиментации в формулу, рассчитывают молекулярную массу белка:

RTs·

~D(l-p/a)'

где R-газовая постоянная; Т-температура (по шкале Кельвина); D-коэффи­

циент диффузии; р-плотностьрастворителя; О"-плотность белковых частиц. Во втором случае измеряют концентрацию белка СI и С2 В двух точках ячейки

на расстоянии Х1 и Х2 от центра ротора в тот момент, когда IЮсле определенного

срока работы ультрацентрифуги в ячейке установится седиментационное равно­

весие, т. е. равенство между числом оседающих и диффундирующих в обратном

направлении молекул белка. Расчет молекулярной массы белка ведут по

формуле, вводя в нее экспериментально найденные значения CI, С2' ХI И Х2:

М=' 2RTlncz/Cl

(l-p/a)ro2 (xf-xf)'

где ro-угловая скорость, а остальные обозначения те же, что в предыдущей

формуле.

Из остальных перечисленных выше физических методов определения моле­

кулярной массы белков широко применяют еще два: гельфнльтрациовный

и электрофоретическИЙ.

.

Первый состоит либо в определении объема элюента, необходимого для

выноса белка из колонки с гелем сефадекса (Ve ), и соотнесении его со свобод­ ным объемом колонки (VO)' либо в установлении длины пробега белка в тон­

ком слое сефадекса на пластинке. И тот и другой показатели связаны зависи­

мостью со значением молекулярной массы белка. Пользуясь калибровочными графиками, построенными по Ve / Vo или по длине пробега маркерных (Т. е. с известной молекулярной массой) белков, находят молекулярную массу

исследуем.ого белка.

36

.второй метод состоит в измерении пути, пройденного белком при электро­ форезе в полиакриламидном геле; здесь тоже существует зависимость между

молекулярной массой белка и длиной пробега. Еще более отчетливо она выявляется при сопоставлении торможения пробега белка при переходе от

электрофореза его в геле с меньшим содержанием акриламида к электрофоре­

зу в геле с большим содержанием акриламида. В этом случае также строят калибровочные графики по маркерным белкам и по ним находят молекуляр­

ную массу неизвестного белка.

Другие физические методы определения молекулярных масс белков: по светорассеянию, вязкости и осмотическому давлению белковых растворов, по

данным рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии-ис­ пользуют крайне редко.

Некоторое распространение имеет химический метод. Сущность его заклю­ чается в количественном определении в составе белка элемента или аминокисло­ ты. содержащихся в нем в наименьшем количестве. Затем проводят расчет

минимальной молекулярной массы, исходя из того, что в молекуле белка не

может быть менее одного атома элемента или одного аминокислотного остатка. Однако об истинной молекулярной массе белка этот метод не всегда

дает правильное представление. Например, гемоглобин (белок крови человека и животных) содержит 0,34% железа. Так как в гемоглобине не может содер­ жаться менее одного атома Fe, то минимальная молекулярная масса гемоглоби­ на рассчитывается по пропорции: 0,34 части Fe соответствует 100 частям белка, 56 частей Fe (ОДИН атом) соответствуют х частям белка, отсюда х=(56·100)/

0,34 = 16 500. Истинная молекулярная масса гемоглобина равна 66000-68000,

т. е. учетверенной минимальной молекулярной массе. Это eCTecTBeHHQ, так как

молекула гемоглобина содержит 4 атома Fe. Таким образом, химический метод

определения молекулярной массы белков в определенной мере условен.

--.-.. -- ФОРМА БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

}..

о форме белковых молекул судят на основании математической обработки

данных, получаемых при ультрацентрнфугиров8IШИ белковых растворов. Для

этой же цели широко используют метод двойного лучепреломления в потоке. Он основан на изменении оптической характеристики раствора белка, находя­

щегося в движении, по сравнению с раствором, нахоДящимся в покое: в пер­

вом происходит ориентация вытянутых белковых частиц по направлению

движения раствора, и это сопровождается феноменом двойного лучепреломле­ ния. Кроме того, форма белковых частиц может быть установлена при непо­

средственном наблюдении в электронном микроскопе. Исчерпывающие дан­ ные о форме белковых молекул и топографии их поверхности дает рентгеност­ руктурный анализ.

С помощью этих методов выяснено, что белковые частицы бывают и ша­ рообразными, и сильно удлиненными-до нитевидных образований. В боль­

шинстве случаев они имеют вытянутую форму и построены асимметрично. Степень асимметрии выражают отношением длинной оси частицы Ь IC ее

короткой оси а. Данные о степени асимметрии (Ь/а) молекул некоторых

белков приведены в табл. 2, а их форма показана на рис. 16.

Белки, у которых степень асимметрии равна 1 (частицы шарообразны),

довольно редки. Чаще всего эта величина бывает в пределах от 3 до 6 (эллип­ совидные или палочкообразные молекулы). В некоторых случаях степень

асимметрии достигает 200 и более (нитевидные белковые частицы). В общем,

37

•		Пепсин		Ге,.,ОеАоОин				jJ - /lокmоело.О!/!,uн
РUООН!lклеаJО		•			•			"'~t;ОШО-;б,О'If/lНН
,.,.,JlllU; q"wиl'1		11-JfOOO,'.1Jx7,'tHH		1f=/iIOIIJ;IIjP5,7HH
			-ГлОО!lлин			..J.,-{лоОулин.
						Cbf60pOmO'lH6IU
					I!fJНН !fgJQОDlКJiJ,ИUjJнн
~ Гла5!1ЛUIf						K lЛоОулuн
-- PI~;'~~~':.::~						cbf60pomOllHbIU
cbl60pomOIlH6/li						--
I1=ZOOl/lJDi .fOXJ/flНI1 •						/,ИOIlIJ(lJ;~"J(2f§1111

n=J'JfНlUUUi l4.f,rltf5im

)

(

/(олласен

11-350000i (,,,.зоо.ОНI'I

Рис. 16, Форма молекул некоторых белков

под названием каждоrо белка указаны ero молекУJIRрнаи масса вдальтонах

в размеры молекул.. в нанометрах

длина белковых молекул средней молекулярной массы лежит в пределах

нескольких десятков, а толщина - нескольких нанометров.

Более поздние работы, в которых была детально раскрыта полная струк­

тура некоторых белков, показали, что белковые молекулы асимметричны во

всех трех измерениях. Так, молекула миоглобина-одного из белков мышеч­

ной ткани (М = 17600)- имеет размеры 2,5 х 3,5 х 4,5 нм (см. с. 71 и 72). Мно­

гим белкам, особенно ферментам, присуща многолопастная структура с на­ личием в их молекулах глубоких расщелин, выпячиваний и впадин, на дне которых располагаются функционально активные центры.

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ

Одним из наиболее распространенных методов исследования химического состава белковых тел является гидролиз. Белок нагревают с растворами

кислот или щелочей при температуре 100-1050 е примерно в течение суток.

Чаще всего используют 20%-ный раствор Hel, обеспечивающий глубокий

гидролиз белка с минимальным раЗРУЦIением аминокислот, из которых он

построен. В последнее время для ускорения реакции гидролиза белков ис­ пользуют иммобилизованные (закрепленные на носителях) протеолитические

ферменты и ионообменные смолы, что обеспечивает полное соответствие

содержания аминокислот в гидролизате соотношению их в белке.

Впервые А. Браконно (1820), используя кислотный гидролиз, выделил из

белка (желатины) аминокислоту-глицин, а Н. Любавин (1871) установил,

что при ферментативном гидролизе белки распадаются до аминокислот.

В последующее время было доказано, что аминокислоты являются почти

единственными продуктами гидролиза белков. Первая аминокислота была получена из сока спаржи в 1806 г. е тех пор из растений, животных и микроор­

ганизмов выделено несколько сотен различных аминокислот; в составе белков

их обнаружено около ЗО, остащ.ные существуют в СJ;lоБОДНQМ виде.

38

В настоящее время фракционирова~

ние аМИНОJ(ИСЛОТ белковых гидролиза~ тов ведут методом ионообменной xpo~ матографни. В колонках с ионообмен~

ными смолами удается разделить

набор белковых аминокислот на co~

ставляющие в течение 1,5-2 ч. Поток

проявителя из колонки направляют

всмеситель, куда поступает раствор

нингидрина, реагируя с которым каж~

дая из аминокислот образует сине-фио~

летовый Руэмана. Подробно эта peaK~

ция описана в практикуме по общей

биохимии 1. Краска подается далее

в фотоэлектроколориметр, связанный

с самописцем, на ленте которого плот­ ность окраски записывается в виде пи­ ков; высота и ширина их соответству·

ют содержанию аминокислоты в гид~

ролизате белка. Будучи скомпонованы

в единый агрегат, перечисленные эле~

менты и дополнительные устройства

к ним образуют прибор, получивший

название автоматического анализатора

аминокиCJIОТ (рис. 17). Этот прибор ра·

ботает автоматически по заданной

7

11

EIJ 12

Рис. 17. Принципиальная схема определения

аминокислот в гидролизате с помощью авто­

матического анализатора:

1,2. З-сосуды с раствором нннrидрнна, буферным раство­

ром дли малой IЮЛОIIПI, буферным раствором дл.. большой IЮЛОImI соответственно, 4. 5, 6-васосы ДЛ8 подачи СООТ­

ветстауюШllJ< растаоров; 7. 8 - малая и большак хромато­ rpaфическне 1I0ЛОIII<И; 9-смеснтель; /О-реакционнаи бвщ; II-фотоэлектро"олориметр; 12-самописец

программе·и определяет содержание амиНОКислот в гидролизате белка (вклю­ чая и выполнение необходИМЫХ расчетов) за несколько часов почти без участия экспериментатора. Если анализатор оборудован компьютером, то на

это. уходит не более 2 ч.

Найденные в белках аминокислоты принято делить на две категории:

постоянно встречающиеся и иногда встречающиеся в белках. Постоянно

встречающихся в белках аминокислот насчитывается 18. Их названия, фор­ мулы и сокращенные обозначения приведены в табл. 4.

Кроме 18 аминокислот в состав белков постоянно входят еще два амида: амид аспарагиновой кислоты-аспарагин и амид глутаминовой кислоты­

.глутамин (сокращенно асн и глн, либо N и Q):

O~		О"C-СНа-СН:г-СН-СООН
C-СНа-СН-СООН
HaN/	~H2	H2N/	~Ha
	Асп,Р8rин		Г"'),Т8МНИ

к группе иногда встречающихся в составе белков аминокислот при­ надлежат оксипролин (оксипирролидин-сх-карбоновая кислота); оксилизин (сх,

Е-диамино~б-оксикапроновая кислота); орнитин (сх, б-диаминовалериановая кислота); 3,S-дииодтирозин; сх-аминоизомасляная кислота; N-метил-, N,N-

диметил~ и N,N,N-триметиллизин; N-мети:л-, N,N'-диметил- и N,N'-диме­

тиларгинин; у-кар60ксиглутаминовая кислота (гла); J3-карбоксиаспарагиновая

. I Здесь и далее даны ссылки на «Практикум по общей биохимии» Ю. Б. Филипповича,

Т. А. Егоровой и Г. А. Севастояновой. 2-е изд., М., 1982.

39