Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

Рис. 4. Жизненный ЦИICЛ и ультраструIC­

тура МИICоплазмы:

/-мембрава; 2-рибосомоподобвые образовании; 3 - фибриллирный ДНК-содер",ащий материал; 4-иедвф· ференцироваИllах терМlIналъваR З0на; 5 - пузырек

предельно проста (рис. 4), а молеку­

лярный состав предопределен набо­

ром только тех соединений, которые

абсолютно необходимы для обеспече­ ния фундаментальных, элементарных

актов жизнедеятельности.

Многочисленные и разнообразные

биополимеры, входящие в состав жи­

вого вещества (см. табл. 1), в значи­

тельной мере реально существуют

в виде биокомплексов, т. е. соедине­

ний нуклеиновых кислот и белков, по-

. лисахаридов и белков, липидов и бел­

ков, полисахаридов и липидов, раз­

личных белков друг с другом и т. п.

Благодаря этому возникают новые

свойства и качества, не присущие био­

полимерам в свободном состоянии. Поэтому изучению структуры и функ­

циональной активности биокомплек­ сов в современной биохимии уделяют

большое внимание.

Высшей ступенью надмолекулярной организации биополимер~в в клетке являются субклеточные частицы (см. рис. 3 и 4). Сочетание белков слипидами дает начало мембранам эндоплазматической сети, митохондрий, лизосом и т. п. Соединение белков с полисахаридами характерно для клеточных стенок. Рибонуклеиновые кислоты, взаимодействуя с белками, образуют рибонуклео­ протеиновые частицы, в том числе рибосомы. Комплексирование ДИК с бел­ ками и небольшим количеством РИК приводит к образованию хроматина,

ана его .основе-хромосомного и, в конечном счете, ядерного аппарата

клетки.

В настоящее время биохимики уделяют особое внимание исследованию

функциональной деятельности субклеточных структур: ядра, митохондрий, пластид, рибосом, лизосом, гиалоплазмы (основное вещество) и др. Раз­

работаны специальные методы препаративного разделения субклеточных

единиц при помощи ультрацентрифугирования, т. е. центрифугирования

при очень быстром (несколько десятков и даже сотен тысяч оборотов

в минуту) вращении ротора центрифуги. Развивающиеся при этом цент­

робежные силы характеризуются фактором разделения (см. с.36), т. е.

отношением ускорения центробежной силы к ускорению силы тяжести,

обозначаемой буквой g. Значения факторов разделения, при которых можно

добиться осаждения из гомогената тех или иных субклеточных частиц,

приведены на рис. 5.

Разделения субклеточных частиц можно добиться также путем пропуска­ пия гомогенатов через колонку с гелем сефарозы. Частицы разного размера фракционируются ~дecь по принциny молекулярного сита (см. с. 30): сначала

из колонки 'Выходят ядра, затем митохондрии и лизосомы, вслед за ними­

обломки эндоnлазматической сети клетки (микросомы) и, наконец, свободные рибосомы.

Отдельные фракции субклеточных частиц используют для пршотовлевиs

так называемых бесклеточных систем, позволяющих выявить функциональ­

ную активность тех или иных структурных элементов клеточного содержимо­

го. Работы с бесклеточными системами позволили впервые проникнуть в сущ-

20

ЦенmРUФУIШро60ние при РО3ЛUVНЫК 3HOVCHURK фактора

РОJiJелениR

Рис. 5. Упрощенная схема диф­ ференциального центрифугиро­

вания гомогената клеток печени

крысы (по ж.-к. Ролан, А. Село- ши иД. Селоши, 1978)

ГомогеНЯЗ8ЦИЮ ТКаНИ и последующее цент.. рифуmрование ведут при О С. Цифры с ле­ вой стороны проБИРОl< УJ<a3ывают моляр­

ные концентрации растворов сахаРОЗЫ2

обеспечивающих в данной зоне пробнрки

ПJlОТНОСТЬ раствора, при ЕОТОРОЙ даЛЫlей­

шее оседание Оllределенных субклеточных

частиц не происходИ1

Гомогенаm	I			I			I
	Ульт		аЦВllтрифУ2иро6ание 6 z а8иенmе
			плотНости сахарозы						6'1
			ЗОмин,			3 '1,
			10000РО, _			1000000,			2000~ecи, _
			.линеш1ыu			сmvgе"чо­			.лuнеиilЬ/U
			epaiJueHm			т~1U гро-			epaiJueHm
						i/Uf:Hm

7,20

1,23

I	I
Ультро,!у/(
1'(,	Рu50СОМЫХ/'1Сl15роны
120000и
Ядрышки
	зНiJоп.лаJмоти­
	ческой сети

ность окислительно-восстановительных процессов в клетке, раскрыть законо­

мерности биосинтеза в най нуклеиновых кислот и белков и сделать ряд других

важных открытий.

Оказалось, что в ядрах, где сосредоточена почти вся клеточная ДИК, идет как ее биосинтез, так и новообразование всех видов РИК. В митохонд­ риях: интенсивно протекают процессы биологического окисления, сопряжен­ ного с образованием важнейшего макроэргического соединения-аденозинт­ рифосфорной кислоты (АТФ), вследствие чего их считают энергетическими центрами клетки. Функция лизосом сводится К осуществлению процессов

деструкции биополимеров при участии разнообразных гидролитических

ферментов, которыми они очень богаты. Рибосомы, представляющие по

современным данным механохимические машины молекулярных размеров,

обеспечивают биосинтез всех клеточных белков. Мембраны эндоплазматиче­

ского реmкулума делят клетку на рЯД,отсеков (компартменты), обеспечивая

компартментализацию (обособленность) ряда химических процессов в ней, избирательный перенос веществ из одной части клетки в другую, равно как

и протекание ряда химических реакций при учасmи ферментов, встроенных

в мембраны эндоплазмаmческой сети. Центриоли имеют отношение к та­

кому важнейшему процессу, как перемещение хромосом в клетке при ее

делении.

Закономерное сочетание деятельности субклеточных частиц лежит в основе жизнедеятельносm клетки, регуляции обмена веществ в ней, быстрой перестройки клетки на новые стационарные режимы функционирования,

21

обеспечивает экономное расходование вещества и существенное увеличение

скорости многоступенчатых биохимических превращениЙ. Именно благодаря

этому в природе осуществляются непрерывное обновление и саморепродукция живого вещества, непрерывный и пока еще во многом таинственный процесс

жизни.

Рассмотрению материальных основ его на уровне молекул посвящены

цоследующие главы.

ГЛАВА II

БЕЛКИ

Этот раздел является наиболее важным в курсе биологической химии, так как белковые тела играют выдающуюся роль и в построении живой материи,

и в осуществлении процессов жизнедеятельности.

Почему именно белки являются важнейшим субстратом жизни? Потому, что

они обладают рядом особеЮlOстей, которые несвойственны никаким другим

органическим соединениям.

1. Гигантские молекулы белков отличаются неисчерпаемым разнообразием

структуры при строгой ее специфичности у данного, конкретного белка.

2. Белкам присуща способность к внутримолекулярным взаимодействиям, что обеспечивает динамичность структуры их молекул, изменчивость и пластичность их формы, обратимость переходов из глобулярного состояния в фибриллярное.

3. Обладая многоликими по химическим свойствам радикалами аминокис­

лотных остатков в составе полипептидных цепей, белковые молекулы в целом

и их отдельные части способны вступать в разнообразные химические и физичес­

кие взаимодействии как друг с другом, так и с нуклеиновыми кислотами; полисахаридами, липидами и т. п., образуя надмолекулярные комплексы, со­ ставляющие основу субклеточm.IX структур.

4. Важнейшей особенностью механизма возникновения указанных комплек­ сов является безошибочное <<узнавание» их ишредиентами друг друга и проте­

кание самого процесса ассоциации по принципу самосборки.

5. Молекулы белков закоиомерно изме8RЮТ свою структуру под влиянием внешнего воздействия и восстанавливают исходное СОСТOJlllИе при его снятии, причем это явление может сопрягаться с акцептированием и преобразованием

энергии.

6. Многие белки обладают уникальной способностью каталитически уско­

рить химические реакции, протекающие в живом веществе.

7. Белкам присущи регуляторные, защитные, токсические, транспортные, сократительные, структурныI,' рецепторныI,' модуляторные, морфогенные, за­ пасные и многие другие функции.

Даже ~TOT далщсо не полный перечень ОСQбенностей белковых тел, отлича­

ющих их от других природных биополимеров, свидетельствует об их важней­

шей роли в обеспечении атрибутов жизни.

Только детально изучив строение белков и их свойства, можно понять как перечисленные особенности белков, так и их функции; поэтому обычно курс биохимии ОТКР~Iвается разделом «Белкю).

ЭЛЕМЕНТАРНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ

Белки, ИЛИ протеины (от греч. nроmос-первый, главный),-высокомолеку­

лярныIe органические вещества, характеризующиеся строго определенным эле­ ментарным составом и распадающиеся до аминокислот при гидролизе.

23

Они содержат (в %): углерода-50-55, водорода-6,5-7,З, азота-15-

18, :кислорода-21-24, серы-до 2,4 и золы-до 0,5. Особенно характерный показатель-процентное содержанне азота. В большинстве случаев оно состав­

ляет 16%, поэтому по содержанию белкового азота часто вычисляют содержа­ ние белка в кормах и продуктах питания. Для этого величину, выражающую

процентное содержание белкового азота в препарате, умножают на фактор

пересчета, равный 6,25, который выводят путем деления: 100:16=6,25.

ВЫДЕЛЕlПIE БЕЛКОВ

Хотя около двух десятков белков (инсулин, рцбонуклеаза, лизоцим, цитохром С, соматотропный гормон, l3-липотропин, ацилпереносящий белок, сх.-бунгароток­ сии, кобротоксин, кардиотоксин, ингибитор гастрина, ингибитор трипсина,

аполипопротеин, ферредоксин др.) удалось синтезировать и, таким образом,

сделать первый шаг на очень трудном пути их искусственного создания, синтезы

эти очень сложны, трудоемки, дJштельныI и дороги. Поэтому единственно

реальным методом получения белков служит выделение их из природных

источников. Но и это нелегкая задача, так как белки обладают особой чувствитель­ ностью к действию большинства химических реагентов (кислот, щелочей, органи­ ческих растворителей и др.) и разрушаются от обычных процедур, применяемых

при очистке веществ (нагревание, перегонка, возгонка, экстракция и т. п.).

Возможен также автолиз (самопереваривание) выделяемых белков. Белок очень

легко теряет свои природные, присущие ему в естественном состоянии нативные

свойства (растворимость, биологическую активность и т. п.), И переходИт в денату­

рированное состоинне. Чтобы избежать денатурации белка в процессе его выделе­

ния, все операции проводят в мягких условиях: при низкой (не выше +50 С) температуре, избегая действия резких химических реагентов.

Впервые белок (клейковина) был выделен Я. Беккари из пшеничной муки

в 1728 г. Эту дату принято считать годом зарождения химии белка. В 1762 г. началась работа по изучению белка молока-казеина (А. Халлер), затем с 1789 г.-белков крови (А. Фуркруа). За два с половиной столетия из природ­

НbIX источников получены сотни различных белков и изученыI их свойства.

Для успешного выделения белка из биологического объекта необходимо

тончайшее измельчение тканей вплоть до разрушения клеточныIx стенок. Для

этого используют (рис. 6) специальныIe валковые (А) или шаровые (Б) мель­

ницы, в KOTOPbIX исходный материал многократно продавливается между тесно сближенными валками или раСПЛЮIЦИвается непрерьmно стал:кивающимися

шарами. С этой же целью широко примеюiют гомогенизаторы (В и Г), в кото­

рых материал либо измельчается острыми ножами, вращающимися с огромной

скоростью (12000 об/мин и более), либо растирается между пришлифованныIи

стенками стеклянных пробирки и пестика, либо в замороженном состоянии

продавливается через фильеры специального пресса (Д).

Хорошие результаты дает метод разрушения клеточных оболочек путем

попеременного замораживания и оттаивания ткани. Роль «рабочего инструмен­

та» вьmолняют здесь кристаллики льда, разрываЮIЦИе стенки клеток и освобож­

даЮIЦИе клеточное содержимое. Применяют также метод «азотной бомбы»,

заключающийся в насьпцении суспендированных клеток газообразным азотом

под высоким давлением, которое затем резко сбрасывают,-"азот, проникший

внутрь клеток, выделяется в виде газа и «взрьmает» их.

Классификация методов разрушения (дезинтеграции) биологического материа­ ла, отражающая разнообразие подходов, используемых с этой целью при

выделении белков и других соединений из природных объектов, приведена в ~бл. 2.

24

Б	в	г	д
Рис. 6. Устройство приборов для измельчения биолоrическоrо
материала при выделении белков;
А - валковаа мельннца (о, и оJ -	валки. вращающиееа навстречу друт друту; пряман

стрелха указывает направление поступления измельчаемого материала); Б-шаРОВ8.

мельница (6, - корпус; 6 z- шары, cтpeJJka указывает иаправление вращеииа корпуса); В-ручной гомоreнизатор (в,-пестик; вz-корпус); Г-механический гомогениза­

тор (z.-нож; г2-камера для измельчения материала; Zэ-J:ОРПУС с электродвига­

телем и пусковым устройством; _. -крышка); Д-рабочая квмера прибора дпа из­

мельчеНИII пресс~методом (д1-прострзнство. заполненное биологическим материа­

лом; д2-плуюк:еры дпя продавливаНИII материала; дэ-стенки камеры; д4- перегородка с тончайшими отаерстнами)

Когда достигнуто тонкое измельчение материала, переходят к следующему этапу-извлечению белков. Белки извлекают чаще всего солевыми растворами, взятыми в концентрации 8-10%. Подавляющая часть белков хорошо раство­ рима в таких солевых растворах. Различные соли обладают разным раство­ ряющим действием по отношению к белку. Ниже приведен ряд катионов и анионов, расположенных в порядке убывания их растворяющего действия:

Li+>K+>Na+

Р20~->В40~->РО1->СNS->НСОз>Г>СГ

Таблица 2

Классификация дезинтеrрнрующих воздействвй по их природе

(по Б. А. Фихте н г. А. IYревнчу, 1988)

Физические			Химические	Энзиматические		БИОЛОгичecпlе
механичесlше	немеханические
Баллистические;	Осмотический,		Действие щело­	Действие бакте­		Действие фаrов,
экструзионные;	тепловой или хо­ чей, кислот,			риолоrических"		бактериоцинов и
ультразвуковые;	лодовый шок; за­		солей, детерrен­	дрожжелитичес­		друrих киллеров
rазодекомпрес­	мораживание­		тов, антибиоти­	ких, миколитичес­ (убийц), внутри­
сорные; rидро­	оттаивание; замо­ ков, хелатных			ких	фермеитов и	клеточных	пара­
ударные; электро­	раживаниевы­		areHToB, орrани­	иммобилизован­		зитов, nлазмидо­
rидроударные;	сушивание; деrи­ ческих раствори­			ных	литических	подобных	факто­
комбинирован­	дратация-ре­		телей	ферментов		ров. Инrибирова­
ные	rидратация; мед­					ние синтеза кле­
	ленная	rазовая				точной оболочки.
	декомпрессия;					Автолиз

фазовые перехо­

ды при высоких давлениях

25

Таким образом, максимальным растворяющим действием должен обла­

дать пирофосфат лития, минимальным-хлорид натрия.

Так как на растворение белков сильное влияние оказывает рН среды, боль­

шинство солей применяют в виде буферных смесей (фосфатных, ацетатных,

боратпых, цитратных и т. п.). В последнее время широко используют буфер­ ные смеси, составленные с применением органических соединений-трис­

(оксиметил)-аминометана (НОСН2)зСNН2 и его соли с НС) (трис-буфер); диэтилбарбитуровой кислоты и ее натриевой соли (веронал-мединаловый бу­ фер); N,N-бис-(2-0ксиэтил)-глицина (HOCH2CH2)2NCH2COOH (бициновый буфер); N-[трис-(оксиметил)-метил]-глицина (НОСН2)зСNНСН2СООН (три­

циновый буфер) и т. п.

Хорошие результатыI дает извлечение белков спирто-солевыми смесями.

Металлопротеины, образующиеся при этом, обладают разной растворимо­

стью в спирте, что позволяет извлекать индивидуальные белки при различной концентрации спирта. Весьма широко прим~няют для экстракции белков

глицерин, предохраняющий их от денатурации.

ИзвлеченИю белков из биологического материала способствует его

обработка детергентами: додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом нат­

рия, тритоном X-IOO, алкилгликозидами и триалкиламмониопропансульфо­

натами:

ДодеlU<1lСУnъфaт натрия

		ДеЭОКCИXO.IIIТ IIIIТPIUI
СНЗ	СНз
НзС-Ь-СНz-t ~(О-СНZ-СН2)9_lIГОН
I	I"=Г-
снз	СНз	Тpиroн Х-l00

(n-(Тре1'<)КТКII}феIlИJlOllыll эфир ПOllllЭ'ПlllеНГJllll[OJIJ[)

		ДодеЦlUl-димеТКll'
	0.__fI, l).rJDOкоlDtpaRО3ИД	.....ОlПlOnpoп.нсуnьфoНlТ (гм -12)
Перечисленные	детергенты ослабляют гидрофобные белково-липидные
и белок-белковые	взаимодействия,	результатом чего являются деструкция

биологических мембран и высвобождение из них структурных и функциональных белковых компонентов. .

Сказанное ВЬПIIе о выделении белков в основном относится к животным

тканям Выделение белков из растительного материала неизмеримо труднее:

здесь сложнее разрушить стенку клеток, более вероятна денатурация белков за

счет их взаимодействия с дубильными веществами и т. П. Поэтому при выделе­

нии белков из вегетативных органов растений используют специфические

приемы: обработку тканей водно-эфирной смесью, резко повышающей прони­

цаемость оболочки растительной клетки (метод Чибнелла), экстракцию бел­

ков смесью фенола, уксусной кислоты и воды (метод Синджа) и др.

26

ПРJlросm lJе'Лf(а, z

А	361ЛDfgЛUII I	Лсе6iJо-	I АЛЬОVМUII
	t	еЛО~VЛUII	t

Рис. 7. Разностные диarраммы высалlf­ вания белков:

А-белки СЫВОРО1КИ крови человека: Б-бе IICИ ге­

МО_"1ИМфЫ шелкопряда. Каждый L: I ОJJбик НИ дии­

грамме соответствует rOMY 1CO..lичес '"ВУ белка. кото­

рое ВЫПИЛО в осаДОК при изменении концентрации

Na2S04 118 0.005 (В единиuaх IЩОIIЮС'"IИ paCTBOPi:I.).

Стрелки указывают ни концеlпраl1ИИ Nи2SО4_ IIB~III"

ющиеси поrраничными ДJIII Оlде.. lения фРВJ:UИЙ друг

01 друга

oL.........

I

После экстракции смеси белков из биологического материала ПР()80ДЯТ

разделение полученной смеси на индивидуальные беЛIEИ, поскольку в состав

растительных и животных тканей входит множество различных белков, экс­ трагирующихся в той или иной пропорции в процессе выделения_ Фракциони­ рование белков ведут разными способами: солями, органическими раство­

рителями, электрофоретически, хроматографически, методом молекулярных

сит и т.п.

Метод фракционнровании белков солевыми растворами основан на том, что

каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при

определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под ,действием срли называется высаливанием. При

дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белох

и, таким образом, последовательно наращивая содержание соли в реакцион­

ной среде, можно один за другим выделить относительно чистые индивиду-

. альные белки. Чтобы определить те границы концентрации соли, в которых происходит осаждение определенного белка, строят разностные диаграммы

(рис. 7).

.

Из органических растворителей для фракционирования белков широко при­

меняют метиловый ,и этиловый спирты (во избежание денатурации белка

процесс ведут при температуре около 50 С). В этих случаях также предвари­

тельно строят разностные диаграммы. На рис. 8 приведены данные о концен­

трациях этилового спирта при осаждении разных фракций белков сыворотки

крови человека. Этот метод нашел широкое применение при выработке заме­ нителей крови, так как позволяет извлекать из нее необходимые ингредиенты

и длительно сохранять их. При фракционировании белков иногда сочетают

высаливание и осаждение спиртом, применяя спиртосолевые растворы.

Метод осаждении ионами тяжелых металлов находит ограниченное приме­ нение при фракционировании белков и осуществляется в большинстве случаев в сочетании с другими методами фракционирования (высаливание, осаждение органическими растворителями). Метод основан на взаимодействии ионов Hg,

Zn, Са, Ва, РЬ, Ре, Cu, U и других тяжелых металлов с реакционноспособными

аминокислотными радикалами белковой молекулы (Hg2 +-c сульфгидриль­ ными группами, Zn2 + -с имидазольными, Са2 + и Ва2 + -с радикалами

фосфосерина и т. п.).

27

Спир((\

Рис. 8. Диаграмма фракционирования белков плазмы

крови человека этиловым спиртом

Метод электрофореза основан на способности различных белков переме­

щаться под ,цействием электрического поля с неодинаковой скоростью (а иногда и в противоположных направлениях) в растворе, на влажной фильтровальной

бумаге или в другой твердой опорной среде. Напряжение при этом устанавлива­

ют от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт, силу тока - в несколько

десятков миллиампер. Скорость передвижения белковых молекул определенно­

го вида к аноду или катоду является функцией электрического заряда, молеку­

лярной массы и формы молекул, ионной силы, рН и состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Сочетание перечисленных факто­ ров всегда специфично для каждого индивидуального белка, и естественно, что

разные белки обладают различной электрофоретической подвижностью. . Наибольшее распространение получил электрофорез в твердых поддер­

живающих средах: целлюлозе, ацетилцеллюлозе, геле агар-агара, крахмаль­

ном и полиакриламидном гелях. На электрофореграммах белки выявляют с помощью красителей: амидового черного (амидошварц 10B), бромфеноло­

БОГО синего, кумасси бриллиантового голубого и др.:

АмидО8ЫЯ черныll

Однако в 100-200 раз чувствительнее реакция обнаружения белков посред­

ством окрашивания их в гелях аммиачными комплексами серебра.

Особенно перспективен метод электрофореза в твердых средах, приготов­

ленных из сополимера акриламида и метиленбисакриламида, имеющего трех­

мерную структуру:

28

в зависимости от соотношения в реакционной среде акриламида и N, N-метиленбисакриламида, трехмерная структура в процессе сополимеризации получается мелко-, среднеили крупноячеистой. При электрофорезе белковые

молекулы с разной степенью легкости проходят через указанные ячейки, что

и обеспечивает фракционирование белков. Так, при фракционировании белков

сыворотки крови человека посредством электрофореза на бумаге наблюдают

6 фракций, в крахмальном геле- 1 О, а в полиакриламидном геле-16 фрак­

ций (рис. 9).

Еще большая дробность фракционирования белковых смесей вплоть до

выделения индивидуальных белков обеспечивается при проведении электрофо­

реза в поддерживающих средах с градиентом рН. Поскольку в этом случае

положение белка на том или ином уровне в колонке или тонком слое носителя

определяется значением его изоэлектрической точки, метод получил название

изоэлектрического фокусирования (синонимы- электрофокусирование, изота­

хофорез). Градиент рН создается при посредстве специально синтезированных

для этой цели О. Вестербергом полиаминополикарбоновых кислот-амфоли­

нов, состав которых выражается следующей формулой:

-СН.-N-(СН,)z-N-СН.-
,	k
(~H.)z
N
('\
где х=2-3, а R-H ИЛИ-{СН2)х-СООН. Молекулярная масса амфолинов
колеблется от 300 до 1000, причем в	зависимости от соотношения в их

молекулах третичных атомов азота и карбоксильных групп в водных раство­

рах амфолинов обеспечивается диапазон рН от 3 до 10.

Хроматографнческий метод разделения белковых смесей заключается в про­

пускании подлежащей фракционированию смеси белков через колонку, за-

Рис. 9. Разрешающая способность твердых подцер­
живающих сред при фракционировании белков сы-		А
воротки крови человека методом электрофореза:
(А-целлюлоза; Б. B-крахмальИLIЙ и полиахриламиднЫЙ reли). На			...
элехтрофореграммах А. Б. В-левак мощнак белковак фракция­
		6	--	I.t
ал"бумин; правая-комплекс у-глобулиноа, между ними-фракции			...l',
остальных глобулинов. Во всех СЛУЧ8КХ исследован ОДИfl и тот же		8
препарат, нанесенный на зону старта в количестве 100, 80 и 5 МI<Л
соответственно	.

29