1.4 Модели функционированияRyR-каналов

Стохастический характер поведения RyR-каналов при стационарных условиях является основной причиной описания данного наноскопического объекта в терминах дискретных по времени однородных марковских процессов.

Простейшей моделью, описывающей стохастическую динамику RyR-канала, является так называемая модель «дыра в стене» (“Hole in the Wall”) [36], которая ограничивает всю совокупность состояний канала двумя состояниями: открытым О и закрытым С. Марковская схема данной модели имеет простейший вид: , гдеи– вероятности открытия и закрытия канала, соответственно. Следует отметить, что данные вероятности зависят от концентрацийи, однако динамика канала представляется как процесс случайного блуждания между состояниями, которые характеризуются различными средними временами нахождения в них. Другими словами, модели, основанные на марковских схемах, являются чисто феноменологическими.

Для более подробного моделирования процессов открытия/закрытия канала применялись более сложные марковские схемы с большим количеством состояний. Состояния канала были сгруппированы в два класса по характеру проводимости: закрытые состоянияи открытые. На рисунке 1.15 представлено несколько типичных модельных схем с различным количеством основных состояний канала, на базе которых проводилось моделирование [37].

Для описания всех известных эффектов, связанных с кинетическими процессами, происходящими в канале (модовая проводимость, адаптация к продолжительной стимуляции), некоторыми исследователями было введено так называемое инактивационное состояние [21, 30, 37-39]. Существование такого состояния объясняется присоединением ионов Са²⁺ к инактивационному центру RyR-канала. Пример марковской схемы с инактивационным состоянием представлен на рисунке 1.16.

Моделирование на основе марковских схем с инактивационным состоянием позволило исследователям воспроизвести результаты экспериментов по наблюдению эффектов адаптации и модовой проводимости.

Однако модели, основанные на марковских цепях, имеют ряд существенных недостатков, таких как:

• Задание предопределенного спектра возможных состояний канала. При попытке описания новых эффектов требуется серьезный пересмотр существующей модели, введение новых состояний, новых видов переходов между ними.

• Выбор спектра состояний модели недостаточно обоснован с точки зрения энергетических свойств и других физических и физиологических факторов.

С учетом всего вышеизложенного возникла потребность создания новых физически и биологически обоснованных моделей для устранения эти недостатков.

Стохастическая динамика и электронно-конформационные взаимодействия в белках

Отдельно следует рассмотреть целый класс стохастических моделей динамики белков, и, в частности, ионных каналов, которые основаны на принципах электронных и конформационных взаимодействий в белках [41-46].

Белковые комплексы рассматривается как вязкоупругие объекты [46], обладающие большим количеством степеней свободы.

Перераспределение химических связей в ходе взаимодействия активных центров белковых соединений с ионами изменяет распределение электронной плотности в реагирующих молекулах, изменяя тем самым баланс сил внутри белка, что приводит к тому, что равновесная конформация белка до и после реакции различны. Это явление называется электронно-конформационным взаимодействием, а соответствующее изменение структуры – электронно-конформационным переходом [45, 47]. Этот переход можно также рассматривать и как конформационную релаксацию под действием нескомпенсированных сил, возникающих после акта перераспределения электронной плотности или иных изменений в активном центре белка. Присоединение очень небольшого по размерам иона к активному центру ионного канала вызывает существенные изменения конформации белка – поворот субъединиц на расстояние порядка 10 А. Этот пример показывает, насколько тонким является баланс сил, стабилизирующих конформацию белковой структуры.

Ярким примером являются непрерывные модели, к примеру, модель процессов открытия Са²⁺-активируемых K⁺-каналов [45]. При разработке данной математической модели авторы основывались на ряде важнейших фактов, выявленных экспериментально и характеризующих кинетику активности ионных каналов, таких как:

1) распределение кинетических параметров может иметь не экспоненциальное, а степенное распределение.

2) распределения имеют фрактальную структуру (самоподобны в различных временных масштабах [47, 48]);

3) существует скоррелированность событий ("память") в активности канала [48].

4) кинетика переходов канала между различными состояниями определяется не только случайными, но и детерминированными силами [48].

В модели [41] конформационное состояние канала и, соответственно, его проводимость определялись с помощью введения угла отклонения подвижных трансмембранных сегментов канала от центральной оси поры (рис. 1.17). Предполагалось, что канал при отсутствии внешних воздействий может находиться в двух устойчивых состояниях (открытое и закрытое). Переходы между состояниями осуществляются благодаря воздействию тепловых флуктуаций на подвижные части сегментов. Потенциальная энергия воротного механизма (структуры) описывается функцией с двумя локальными минимумами, соответствующими открытому и закрытому состояниям канала (рис. 1.17г).

Таким образом, существует альтернатива теориям, основанных на марковских процессах, описывающих процессы открытия/закрытия ионных каналов. Вышеописанные модели позволяют более детально описать динамику биомолекул и предполагают использование энергетического подхода к описанию конформационных изменений различных биофизических объектов.

1.5 Кооперативная динамика группы RyR-каналов. Са²⁺-высвобождающая единица

Начальное возрастание концентрации внутриклеточного кальция в ответ на электрическое возбуждение происходит благодаря поступлению ионов извне через L-каналы, однако такого повышения концентрации недостаточно для сокращения клетки [1, 11, 50, 51]. Внешний приток Са²⁺ активирует группы RyR-каналов, являясь стимулом для последующего высвобождения Са²⁺ из СР и повышения уровня Са²⁺ в цитозоле на порядок величины. Данный триггерный процесс носит название «кальцием вызванное высвобождение кальция» (КВВК) [1]. После высвобождения Са²⁺ из СР в диадное пространство и дальнейшей его диффузии в цитозоль увеличивается концентрация Са²⁺ вблизи миофибрилл, что приводит к сокращению саркомера. Относительная однородность повышения концентрации Са²⁺ в клетке обеспечивается особым устройством СР с небольшим расстоянием (не более 1 мкм) от любой точки клетки до ближайшей высвобождающей единицы [10].

Являясь одним из ключевых процессов электромеханического сопряжения, процесс КВВК требует тщательного экспериментального анализа и соответствующего математического моделирования.

1.6 Локальные высвобождения Са²⁺в кардиомиоцитах

Важным этапом в исследовании динамики Са²⁺ в кардиомиоцитах являются эксперименты по изучению локальных высвобождений Са²⁺ в клетках при помощи конфокальной микроскопии и Са²⁺-чувствительного индикатора fluo-3, fluo-4, или rhod-2 [51]. Резкое локальное повышение концентрации цитозольного Са²⁺ в покоящейся клетке, называется Са²⁺ спарком [52-54]. Спарки в клетке наблюдаются с частотой около 100 в секунду [53].

На рисунке 1.18 приводятся результаты продольного сканирования сердечной клетки крысы, которая загружена индикатором fluo-3. Каждый Са²⁺ спарк является по форме почти сферическим с приблизительным диаметром 2 мкм. Как видно из рисунка 1.18в, значение концентрации покоя Са²⁺ около 100 нM, а значение локальных пиков концентрации от 200 до 300 нM.

Поскольку Са²⁺ спарки формируются кластерами RyR-каналов, они преимущественно наблюдаются вдоль саркомера и T-тубулы. На рисунке 1.18б представлено усредненное изображение спарков перпендикулярно Т-тубулы.