Оснабрюкському центрі:

А – молоді бугайці, що оцінюються по системі ЕТ/ДТ (ембріотрансплантація / донор-тест); Б – станція штучного осіменіння (спермою кожного бугая осіменяють по 800 корів на рік); В – чотирьорічний період очікування результатів оцінки; Г – вибракувані бугаї; Д – бугаї, що оцінюються за якістю нащадків; Е – бугаї-поліпшувачі, що зайняли 1-е, 2-е і 3-е місця.

Після оцінки бугаїв які зайняли І, ІІ і ІІІ сходинки відбирають для селекційно – племінної роботи, а інших бракують.

Робота одночасно з самцями і самками дозволяє створити методи довгострокового зберігання зародків, запліднення і селекції яйцеклітин in vitro, а також клонування ембріонів.

2. Теоретичні передумови трансплантації ембрiонiв

Взагалі трансплантація ембріонів, (перенесення їх з репродуктивного тракту самки – донора до репродуктивного тракту самки – реципієнта), базується на здібності предінплантиційного ембріону деякий час зберігати життєздатність поза організмом матері і на явищі толерантності останнього до зародку, що в ньому розвивається.

Імунологічна толерантність яйцеводів і матки на стільки велика, що в них можуть розвиватися не тільки особисті ембріони (з чужими, тобто батьківськими антигенами), але і гетерогенні ембріони (неспоріднені ембріони однієї породи, міжпородні і міжвидові).

Трансплантація ембріонів базується також на відсутності змін в геномі трансплантата, що розвивається в чужому організмі реципієнта, але залежність імунного статусу трансплантата від органiзма реципієнта дає можливість передбачувати зміни в реактивності генома на оточуюче середовище.

Трансплантація ембріонів у різних видів с.-г. тварин відрізняється між собою. (Наприклад у свині ембріотрансплантація відбувається тільки хірургічним методом, що пов’язано з анатомічними особливостями її репродуктивного апарату).

Метод трансплантації ембріонів, суть якого полягає в пересадженні їх доімплантаційних стадій розвитку (морул та бластоцист) від корови-донора телиці-реципієнту, в організмі якої відбувається його ріст і розвиток до народження, складається з важливих взаємозв’язаних ланок біотехнологічного процесу, а саме: стимуляції суперовуляції у донорів, їх осіменіння, не хірургічного вимивання, пошуку, оцінювання життєздатності ембріонів та підготовки реципієнтів і пересадження їм зародків. Кожна із цих ланок ще остаточно не досліджена й їх методики удосконалюються. Завдяки розробці методик замороження ембріонів та довготривалого зберігання їх у рідкому азоті метод трансплантації можна умовно розділити на два етапи: перший закінчується замороженням ембріонів та їх реалізацією; другий, включає добір реципієнтів, техніку підготовки та трансплантацію зародків. Ці етапи набули самостійного генетико-селекційного та економічного значення в тваринницькій галузі.

Перший етап розпочинається із добору донорів та наступною стимуляцією у них суперовуляції. Суперовуляція (поліовуляція), це чисельний ріст фолікулів на яєчниках та їх овуляція, індуковані (стимульовані) введенням екзогенних гормонів. Нині найбільш поширені три схеми стимуляції суперовуляції гонадотропними гормонами та синтетичними аналогами простагландину F2α (ПГ). Схеми розділяються кількістю введених в організм донорів доз ПГ, а саме – одну (враховуючи спонтанну статеву охоту), дві, або три. Найчастіше використовують схему

з ін’єкцією двох ПГ. Останню дозу ПГ вводять після обробки донорів одним із гонадотропних гормонів, до яких належать фолікулостимулювальний гормон (ФСГ) та гонадотропін сироватки жеребних кобил (ГСЖК).

Ембріони вимивають із матки корів-донорів після їх осіменіння на 7-му, 8-му добу статевого циклу, визначивши до цього рівень суперовуляції, який залежить від кількості жовтих тіл в яєчнику, підрахованих під час ректальних досліджень, або за допомогою ультразвукового сканера. Дні статевого циклу починають рахувати від дня статевої охоти, який приймається за нульовий день.

Слід відзначити, що 20…30% тварин не реагують суперовуляцію на екзогенні гонадотропні гормони, а у 9…13% донорів під час поліовуляції не отримують ембріонів. Спостерігається також різна ефективність стимуляції суперовуляції у донорів гонадотропними гормонами. ФСГ порівняно з ГСЖК за всіх рівних умов більш ефективний: за кількістю тварин, які реагують суперовуляцією, за виходом загальної кількості ембріонів та їх якістю. Негативний вплив ГСЖК зумовлений більш тривалим періодом (~10 діб) напіврозпаду препарату за рахунок наявності в ньому сіалових кислот. Надлишок ГСЖК нейтралізують введенням антисироватки, що поліпшує результати суперовуляції. Використання високоочищеного ГСЖК дозволяє також підвищити результати суперовуляції.

Для покращання результатів суперовуляції використовують аналоги гонадоліберинів або ЛГ («Овогон-тіо») у схемах обробки донорів гонадотропними гормонами, що синхронізує овуляцію фолікулів та збільшує кількість придатних до пересадження ембріонів. Обробка донорів тканинними препаратами з вітамінами, вимивання ембріонів з використанням антибіотиків, розробка нових середовищ і попередня санація матки також дозволяють збільшити кількість придатних ембріонів.

Після вимивання проводять пошук ембріонів у вимивному середовищі та оцінюють придатність до пересадження за відповідністю стадії розвитку його віку та морфологічними ознаками, за якими їх розділяють на «відмінні», «добрі», «задовільні», непридатні, дегенеровані. Далі «відмінні» та «добрі» ембріони заправляють у маркіровані (індивідуальний номер донора, стадія розвитку ембріона) пайєти, у яких їх заморожують, або вставивши у катетери пересаджують реципієнтам.

Кріоконсервування ембріонів проводять різними методами, які відрізняються між собою швидкістю охолодження, відповідно застосованими кріопротекторами та способами їх насичення. В Україні в практиці методу трансплантації ембріонів широко використовують повільні швидкості заморожування, які отримують у спеціальних апаратах, з однощаблевим насиченням гліцерину (1,4 М розчин в середовищі Дюльбекко із 0,4% бичачого сироваткового альбуміну). Для

зменшення затрат праці та зниження вартості кріоконсервації розробляються методи вітрифікації ембріонів ссавців, підгрунтям яких є використання високих та надвисоких швидкостей заморожування-відтавання, які дозволяють занурювати пайєти із зародками в рідкий азот від кімнатної температури.

Другий етап складається із підготовки реципієнтів і катетерів та пересадження ембріонів як нативних, так і заморожених хірургічним, або не хірургічним способом. Необхідним фоном, який забезпечить високий рівень приживлюваності ембріонів у разі нехірургічного пересадження, є комплекс передумов: відповідний морфологічний стан і стадія розвитку зародків; точна синхронізація еструсу у донора і реципієнта; місце аплікації ембріона в розі матки; стерильність під час підготовчої роботи і пересадження ембріонів; зняття напруги з рогів матки; виключення стрес-факторів; забезпечення постійної температури під час короткочасного зберігання ембріонів; використання для суперовуляції гормонів, які зумовлюють меншу мінливість у стадіях розвитку ембріонів; визначення концентрації прогестерону в крові реципієнтів перед пересадженням ембріонів (не менше 2 нг./мл); екзогенне введення прогестерону за 45…50 год. до або біологічно активного препарату глютам після пересадження ембріонів; використання плідників і корів-донорів, вільних від хромосомних аномалій; забезпечення необхідних умов під час маніпуляцій з ембріонами в умовах in vitro.

Серед перерахованих чинників найбільше впливають на приживлюваність ембріонів генотип плідника; якість зародків; відповідність дню циклу реципієнта і стадії розвитку зародка; якість виконаних процедур під час пересадження ембріонів.

Трансплантацію ембріонів можна розглядати як самостійний селекційний метод, який не замінює, а тільки доповнює штучне осіменіння тварин. З часу приручення тварин до наших днів людина прагне отримувати від кращих тварин велику кількість потомків.

Впровадження трансплантацiї ембрiонiв у практику тваринництва сприяє наступному: одержанню еталонних тварин; вивченню ранніх етапів ембріогенезу; вивченню впливу організму реципієнта на реалізацію генотипу трансплантата; удосконаленню техніки одержання двійнят; розробці методів вимивання, відшукуванню, оцінці якості i консервуванню ембрiонiв; удосконаленню техніки трансплантацiї вивченню факторiв, що впливають на переживання i нiдацiю (приживлення) ембрiонiв у матці реципієнта; розвитку нової галузі науки – імунології розмноження; розгортанню досліджень виділення, клонування, трансплантацiї тих чи інших генів, утворення химер; розробці імунологічних i цитогенетичних методів визначення статі ембрiонiв; розробці методики розділення ранніх ембрiонiв (отримання деми-ембрiонiв) i одержання ідентичних двійнят; вивченню запліднення яйцеклітин ссавців in vitro; розширенню впливу на яйцеклітини фiтоестрогенiв (люцерни, конюшини тощо); вивчення проблеми толерантності, одержання толерантних зигот, стійких до різних умов, розробляти методи одержання толерантних органiзмiв.

Вивчення запліднення i розвитку запліднених яйцеклітин, показує, що більшою самостійністю, незалежністю вiд материнського організму володіють тi яйцеклітини, у яких є достатній запас поживних речовин (наприклад, у вигляді жовткових зерен) у межах цитоплазми, або тi, якi порiвняно легко можуть переходити до стану анабіозу пiд впливом фізичних i хімічних факторiв. Яйцеклітини с-г ссавців (В.Р.Х., коні, свині тощо) відносяться до мало жовткових. Це слід мати перш за все на увазі при розробці технології трансплантацiї i здійснювати наступне: забезпечення заплідненості клітини живленням у залежності вiд стадії її розвитку in vitro захистити зиготу вiд впливу факторiв навколишнього середовища (температура, світло, рН, тощо); захистити зиготи вiд інтоксикації профiлактувати травмування зиготи при вимиванні, технологічній обробці, зберіганні; розробити досконалі способи переведення зиготи до стану анабіозу.

Трансплантація зигот відкриває у скотарстві реальні можливості одержувати вiд однієї корови не 8-12 телят протягом життя, а до ста за рік. Це дозволяє отримати більшу кількість потомства вiд високопродуктивних корiв, підвищити багатоплiддя за рахунок одночасної пересадки двох зигот i поділу бластомерів. Створюються умови для оцінки корiв за якістю потомства. Трансплантація ембрiонiв підвищує ефективність i скорочує час по створенню високопродуктивних стад, розширює діапазон можливостей вивчення ембріональної смертності, причин, що її обумовлюють та розробки заходів профілактики. Трансплантація створює умови вивчення взаємовідношень ембріон – мати, мати – ембріон. Застосування методів консервування по тривалому зберіганню ембрiонiв in vitro забезпечує умови збереження і раціонального використання генофонду.