Методи контролю

Визначення концентрації джерела вуглецю (метод Мюллера)

Реактив Мюллера складається з сульфату міді, сегнетової солі та карбонату натрію.

Метод визначення ґрунтується на окиснені редукуючи цукрі сіллю двовалентної міді та прямому визначенні відновленої форми міді в присутності її окисненої форми 24.

Метод визначення: у термостійку конічну колбу вносять 25 мл досліджуваного розчину, в якому міститься 15-40 мг/100 мл редукуючи цукрі і додають 10 мл реактиву Мюллера. Колбу витримують 10 хв у киплячій водяній бані так, щоб рівень розчину в ній був на 2-3 см нижчим, ніж рівень води у бані. Дно колби не повинне торкатись дна бані. Після десятихвилинного кип’ятіння колбу виймають з бані, швидко охолоджують до кімнатної температури 24.

Розчин повинен мати голубе або зелене забарвлення. Наявність жовтого забарвлення вказує на недостатню кількість реактиву Мюллера. У цьому випадку дослід слід повторити. Після охолодження додають 5 мл оцтової кислоти і 5-20 мл розчину йоду концентрацією С = 1/30 моль/л. колбу закривають корком і залишають на 2 хв при кімнатній температурі, періодично перемішуючи суміш. Надлишок йоду титрують розчином N₂S₂O₃ до появи блідо-жовтого забарвлення, надалі додають 2-3 мл 0,5% розчину крохмалю. титрування завершують після досягнення зеленого забарвлення розчину23.

Паралельно ставлять контрольний дослід за цією ж методикою, але без кип’ятіння. Вміст редукуючи цукрі розраховують з врахуванням того, що 1 мл витраченого на реакцію розчину йоду відповідає 1 мг інвертного цукру:

C = 100(V₁ – (V₂ – V₃))_n/1000V

V₁ – об’єм доданого розчину йоду, мл;

V₂ – об’єм розчину Na₂S₂O₃, витрачений на титрування в контрольному досліді, мл;

V₃ – об’єм розчину Na₂S₂O₃, витрачений на титрування в основному досліді, мл;

n – ступінь розбавлення специфічного розчину;

V – об’єм аналізованої проби, мл 24.

Визначення концентрації джерела азоту

Метод Несслера – найбільш загальноприйнятий і поширений для визначення вмісту аміаку і амонійних солей. Cуть методу полягає в утворенні колоїду, пофарбованого в червоно-бурий колір, при взаємодії аміаку і амонійних солей з реактивом Несслера. Цей реактив є лужним розчином меркурійодидакалію [24]. 

Забарвлення, що виникає, поглинає випромінювання в широкому діапазоні довжин хвиль і в певних умовах інтенсивність забарвлення пропорційна кількості амонію. Фотометрують при 400 – 425 нм (для кількостей < 0,2 мг NH3) і при 550 – 580 нм (для ~ 1 мг). При вимірюванні на спектрофотометрі межа концентрацій може бути розширена до 1,25 мг (при 580 нм). При визначенні мікрограмових кількостей азоту оптична густина розчинів зберігається постійною протягом 6 год. Якщо реакція протікає довше 15 – 20 хв., то при вмісті азоту > 1 мг може спостерігатися опалесценція або помутніння розчину [24]. 

Для отримання точних результатів, необхідно дотримуватися умов проведення реакцій та приготування реактиву Несслера. Концентрація аналізованого розчину повинна бути в межах 0,5 – 0,6 н [24]. 

Визначення активності кислотності з використанням рН-метра

Суть методу полягає у визначенні різниці електричних потенціалів між двома електродами, зануреними в дослідний розчин, яка залежить від показника рН. Її величину виміряють системою із скляного електроу (вимірювальний) і каломельного електроду (порівняльний) [24]. 

Прилади і посуд: рН-метр-мілівольтметр або іономір універсальний з межами вимірів рН від мінус 1 до плюс 14, термометр, стакани лабораторні місткістю 50 і 100 см³, бюретка місткістю 20 см³, розчин гідроксиду натрію концентрацією 0,1 моль/дм³.

Техніка аналізу. Перед початком вимірювань прилад прогрівають протягом 60 хв., потім його перевіряють по буферному розчину калію фталевокислого концентрацією 0,05 моль/дм³, який має рН 4,0 при температурі 20^оС. електроди перед зануренням в дослідну рідину ретельно промивають дистильованою водою, а потім декілька разів дослідною рідиною. Електроди приладу занурюють в дослідний зразок. Перемикач «Межі вимірювання» встановлюють в положення, що вимірює рН вимірювального розчину, і роблять відлік показів по шкалі приладу [24]. 

За кінцевий результат приймають середнє арифметичне значення результатів двох паралельних вимірів рН, розбіжність між якими не перевищує 0,1 [24]. 

Визначення концентрації біомаси

Концентрацію біомаси визначаємо за оптичною густиною клітинної суспензії із наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком [24]. 

У пробірки із 9 мл дистильованої води вносимо по 1 мл культуральної рідини. Суміш збовтується, потім вимірюється оптична густина (при 540 нм), отримані дані перераховують за калібрувальним графіком [24].

Визначення сторонньої мікрофлори

Чистоту культуральної рідини визначають посівом її на різноманітні середовища.

Присутність бактерій групи кишкових паличок визначають посівом культуральної рідини в пробірки з середовищем Кесслер, посіви термостатують при температурі при температурі 43-45 ^оС протягом 24 год. Відсутність газу у пробірках свідчить про те, що культуральна рідина не забруднена БГК. Поява газоутворень свідчить про те можливе забруднення закваски цим видом бактерій. Для підтвердження наявності БКГ проводять посіви із пробірок де відмітили наявність газу на середовище Ендо малинових колоній з блиском відбирають мазки, фарбують за Грамом та мікроскопіюють. Наявність грам негативних паличок свідчить про присутність БКГ [24]. 

Для визначення наявності дріжджів та пліснявих грибів культуральну рідину висівають на чашки Петрі на сусло-агар, культивують при температурі 24^оС [24]. 

Стрептококи виявляють на щільному середовищі з цитратом кальцію.

Оцтовокислі бактерії визначають посівом розведень у стерильне знежирене молоко, культивують в термостаті при 30 ^оС протягом 24 год. Наявність жовтого кільця на поверхні молока свідчить про присутність оцтовокислих бактерій [24]. 

Визначення кількості живих колі бактерій в одній дозі препарату

Кількість живих колі бактерій в одній дозі препарату визначають на трьох зразках препарату від кожної серії.

Цю кількість колі бактерій в одній дозі препарату перевіряють паралельно з робочим стандартним зразком (РСЗ) Колібактерину. Робочий стандартний зразок Колібактерину – суха завись колі бактерій Escherichia coli М 17 по 5 доз у флаконах містить 10⁹ живих мікробних клітин в одній дозі. зберігати за температури мінус (182) ^оС 22.

Вміст флаконів Колібактерину та РСЗ розводять водою Р з розрахунку 1 см³на одну дозу та залишають на 1 год за кімнатної температури для регідратації біомаси. Отримані мікробні суспензії препарату та РСЗ по 1 см³ переносять у пробірки, що містять по 9 см³ казеїнового бульйону та перемішують 12 – 15-кратним покачуванням, отримуючи при цьому одну дозу колі бактерій в об’ємі 10 см³ середовища (розведення 10^-1). Із цих пробірок роблять послідовні десятикратні розведення до 10^-10. Пробірки з розведеннями досліджуваних зразків препарату та РСЗ у поживних середовищах переміщають у термостат за температури (381) ^оС та інкубують протягом 4 діб 22.

Після закінчення інкубації відмічають розведення, в яких є ріст колоній колі бактерій у вигляді «цвяхів», «кришок», «ниток».

Кількість живих колі бактерій N в одній дозі визначають за формулою

N = n  10^m-1

n – кількість колоній в одній пробірці;

m – величина розведення мікробної суспензії.

Якщо ріст бактерій спостерігається в розведенні не менш ніж 10^-10, то це свідчить про задовільні ростові властивості поживного середовища та достовірність результатів аналізу. Якщо в ряду розведень РСЗ ріст спостерігається в розведенні, меншому ніж 10^-10, то дослід потрібно повторити на іншій серії поживного середовища 22.