ХОД РАБОТЫ

*Задание Определить концентрацию мочевины в сыворотке крови с использованием тест-набора клинического назначения

1. Готовят опытную, стандартную и холостую пробы в соответствии с таблицей:

	Ингредиенты	Опытная	Стандартная	Холостая
		проба, мл	проба, мл	проба, мл
	Сыворотка крови	0.2	−	−
	Мочевина, стандарт	−	0.2	−
	Дистиллир. вода	0.8	0.8	0.5
	ТХУ	1.0	1.0	−

2.Опытную и стандартную пробы перемешивают стеклянной палочкой, выдерживают 15 мин, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин.

3.Из центрифужных пробирок опытной и стандартной проб отбирают по 0.5мл супернатанта, вносят по 5мл цветного реактива (к 0.5 мл холостой пробы также добавляют 5 мл цветного реагента) и содержимое пробирок перемешивают.

4.Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Затем охлаждают 2-3 мин под струей воды.

5.Оптическую плотность опытной и стандартной проб измеряют при длине волны 540 нм, используя в качестве контроля холостую пробу.

6.Расчет концентрации мочевины в сыворотке крови производят по формуле:

Х= Еоп 16.65,

Ест

где Х - концентрация мочевины в сыворотке крови (мМ), Еоп – оптическая плотность опытной пробы, Ест – оптическая плотность стандартной пробы,

16.65 - концентрация мочевины в стандартном растворе (мМ).

Примечание: норма содержания мочевины в сыворотке крови составляет 2.5- 8.3 мМ.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические материалы по лабораторной работе.

25

Во время занятия:

2.Описать этапы работы.

3.Построить калибровочные графики.

4.Оформить результаты измерений.

5.Сделать выводы.

26

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу «Патобиохимия»

Тема:

Цель работы:

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Определение перекисного гемолиза эритроцитов и уровня восстановленного глутатиона в эритроцитах крови человека

Определить уровень перекисного гемолиза эритроцитов. Определить соотношение концентраций восстановленной и окисленной форм глутатиона в эритроцитах крови человека

Оборудование и материалы:

•Центрифуга UNIVERSAL 30RF

•Пробирки центрифужные

•Спектрофотометр SOLAR

•Кюветы полистирольные

•Автоматические микропипетки

•Пробирки

•Штативы для пробирок

•Цилиндры мерные на 50-100мл

•Бумага фильтровальная

•Палочка стеклянная

Реактивы:

•Цельная кровь

•Натрий хлористый (NaCl), 17% раствор

•Калий-фосфатный буфер, pH7,4

•Вода дистиллированная

•Кровь цельная (соотношение с антикоагулянтом - 4:1)

•Осаждающий реактив:

метафосфорная кислота (HPO3), трилон Б, хлористый натрий (NaCl)

• Реактив Эллмана:

0.04% раствор 5,5,-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) в 1% растворе цитрата натрия трехзамещенном

•Гидроортофосфат натрия (Na2HPO4), 0.3М раствор

•Глутатион восстановленный, стандартный раствор (5мМ)

•Физиологический раствор (NaCl, 0.9% раствор)

•Вода дистиллированная

27

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Антиоксидантная система защиты клеток от действия продуктов перекисного окисления липидов

Процессы биологического окисления в клетках в норме представлены рядом метаболических (катаболических) путей, которые включают последовательные ферментативные реакции дегидрирования, то есть отщепления атомов водорода от окисляемого соединения, а кислород, как правило, присоединяется не к самому окисляемому веществу, а к высвобождаемым атомам водорода с образованием молекул воды. Вместе с тем, в разных клетках присутствуют также специфические ферменты или даже мультиферментные системы, которые, используя молекулярный кислород, способны непосредственно внедрять один (монооксигеназы) или два (диоксигеназы) атома кислорода в окисляемый субстрат.

Наконец, под действием ряда ферментов или в ходе неферментативных реакций, катализируемых следовыми количествами переходных металлов, может происходить инициирование аутокаталитических цепных реакций, в которых основными субстратами выступают соединения, содержащие двойные связи, чередующиеся с метиленовыми мостиками. Такие особенности структуры характерны для природных полиненасыщенных жирных кислот. Приведенная ниже последовательность реакций включает регенерирование радикала R·, обеспечивающего развитие цепной реакции, и одновременное образование в присутствии кислорода органических гидроперекисей, которые могут распадаться на два кислородсодержащих радикала, вступающих в последующие реакции:

Указанную последовательность реакций можно также представить в виде следующих уравнений:

28

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в присутствии кислорода вызывает in vivo повреждение тканей, способствуя развитию опухолевых заболеваний. Процессы перекисного окисления in vivo могут катализироваться гемовыми белками и липоксигеназами, входящими в состав тромбоцитов, лейкоцитов, эритроцитов и других форменных элементов крови. Повреждающее действие инициируется свободными кислородсодержащими радикалами – ROO·, RO·, HO·, возникающими в ходе образования перекисей жирных кислот.

Одним из неблагоприятных последствий перекисного окисления липидов считается накопление малонового альдегида, образующегося в результате радикального разрыва полиеновых жирных кислот. Этот бифункциональный альдегид способен образовывать Шиффовы основания с аминогруппами белков, выступая в качестве внутри- и межмолекулярного сшивающего агента. В результате сшивки формируются нерастворимые липид-белковые ком-

плексы, называемые пигментами изнашивания.

Контроль за физиологическим уровнем продуктов ПОЛ осуществляет мощная естественная антиоксидантная система, включающая низкомолекулярные антиоксиданты (α-, β-, γ- и δ-токоферолы, аскорбиновую кислоту, β- каротин, мочевую кислоту, убихинон), а также ферменты антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпероксидазу, глутатионредуктазу, церрулоплазмин). С целью повышения эффективности антиоксидантной защиты клеток организма в пищевые продукты часто добавляют искусственные антиоксиданты – пропилгаллат, бутилированный гидроксианизол и бутилированный гидрокситолуол. Антиоксиданты способны терминировать процесс ПОЛ или нейтрализовывать продукты ПОЛ. В связи с этим антиоксиданты подразделяют на два класса:

1)превентивные антиоксиданты, снижающие скорости инициации цепных реакций;

2)гасящие (прерывающие цепь) антиоксиданты, препятствующие развитию цепных реакций.

Кпервому классу антиоксидантов относят каталазу и другие пероксидазы, способные разрушать гидроперекиси (ROOH), а также агенты, образующие хелатные комплексы с металлами – диэтилентриаминпентаацетат и этилендиаминтетраацетат. В качестве антиоксидантов второго класса, пре-

29

рывающих цепные реакции, часто выступают фенолы или ароматические амины. В условиях in vivo главными антиоксидантами второго класса являются супероксиддисмутаза, которая улавливает в водной фазе свободные супероксидные радикалы, а также витамин Е, улавливающий свободные ROO·- радикалы в липидной фазе.

Недостаток антиоксидантов в организме приводит к инициированию процессов непосредственного присоединения кислорода к окисляемым соединениям с образованием альдегидов, пероксидов, свободных радикалов, которые в химическом отношении являются высокотоксичными и весьма агрессивными веществами. В этом случае нарушается нормальное течение физиологических процессов: блокируется депонирование энергии в форме АТР, энергия рассеивается в виде тепла. Повреждаются клеточные мембраны, ферменты, структурные белки. Повреждение структурных белков, в частности, проявляется в нарушении синтеза эластических волокон артериальных стенок, что служит причиной предрасположенности к развитию атеросклероза. Этому явлению способствует состояние гиперхолестеринемии, возникающее за счет нарушения процессов превращения стеринов в желчные кислоты в присутствии пероксидов липидов, которые в норме осуществляются в гепатоцитах.

Одним из высокоэффективных компонентов системы антиоксидантной защиты является витамин Е, который представлен смесью из 4 токоферолов и 4 токотриенолов. На рис. 3.1 приведена структурная формула α- токоферола.

Рис. 3.1 Структурная формула α-токоферола. У β- и γ-токоферолов в положениях 7 и 5, соответственно, заместителем является Н. δ-токоферол содержит Н в 5 и 7 положениях.

Как витамины наиболее активны α-, β- и γ-токоферолы, эффективность которых выражается отношением 100:40:8. С другой стороны, наиболее сильные антиоксидантные свойства присущи δ-токоферолу.

30

Витамин Е является первым уровнем защиты клеточных и субклеточных мембранных фосфолипидов от перекисного окисления. Токоферолы действуют как антиоксиданты, прерывающие цепи окисления, благодаря их способности переносить фенольный водород на пероксидный радикал (рис. 3.2). Феноксирадикал токоферола является резонансно-стабилизированной и достаточно устойчивой структурой.

Рис. 3.2 Гасящее цепную реакцию антиоксидантное действие токоферолов по отношению к ROO·-радикалам.

Исходя из сказанного выше, следует, что токоферолы практически не вовлекаются в процесс цепной реакции. В ходе окисления хроманолового кольца и боковой цепи токоферолов образуется продукт, не являющийся свободным радикалом:

Этот продукт образует коньюгат с глюкуроновой кислотой и экскретируется с желчью. Необходимо отметить, что в подобные реакции с ROO·- радикалами вступают фенолы, причем феноксирадикалы фенолов отличаются повышенной устойчивостью, особенно замещенные по 2-ому, 4-ому или 6-

ому положениям.

31

Следовательно, способность к образованию относительно устойчивых свободных радикалов токоферолов можно объяснить как наличием хроманольной структуры, так и присутствием метильных заместителей в положениях 5 и 7 (см. рис. 3.1).

Витамин Е выполняет в организме млекопитающих, по крайней мере, две метаболические функции. Во-первых, он служит сильнодействующим природным жирорастворимым антиоксидантом и, во-вторых, выполняет специфическую роль в метаболизме селена. Действительно, многочисленные данные свидетельствуют о наличии взаимосвязи между пищевой потребностью в селене и витамине Е. Поскольку недостаточность витамина Е сопровождается низким содержанием селенида (Se2-), было высказано предположение, что витамин Е предохраняет восстановленный селен от окисления с образованием селенита (SeO32-) или других более окисленных состояний селена.

Антиоксидантное действие α-токоферола сохраняется при высоких концентрациях кислорода, поэтому неудивительно, что витамин Е накапливается в богатых липидами областях, контактирующих со средой, где поддерживается высокое парциальное давление кислорода - в мембранах эритроцитов и клеток дыхательных путей. Типичное проявление нехватки токоферолов – выраженная миодистрофия, которая охватывает как скелетные (особенно, диафрагмальную), так и гладкие мышцы, а также миокард. Происходит деструкция митохондрий, фрагментация мышечных волокон, появляются микронекрозы. Гиповитаминоз Е сопровождается тканевой гипоксией в органах с высокой потребностью в кислороде. Известно снижение резистентности эритроцитов к гемолизу, наступающее при гиповитаминозе Е. Вследствие перекисной трансформации эритроцитарных мембран, красные кровяные клетки приобретают шиповатую форму (акантоцитоз). У недоношенных детей, а также у обезьян может проявляться острая гемолитическая анемия, купируемая витамином Е. Таким образом, действие витамина Е и селена состоит, по-видимому, в предохранении клеточных и субклеточных компонентов от повреждения перекисями, обеспечивая их целостность.

Однако даже в присутствии адекватного количества витамина Е может происходить образование некоторого количества пероксидов. Вторым уровнем защиты мембран от разрушающего действия перекисей служит селенопротеид – глутатионпероксидаза – катализирующий реакцию окисления глутатиона пероксидом водорода.

Принимая во внимание все сказанное выше можно утверждать что, определение степени насыщенности организма антиоксидантами является важным прогностическим и диагностическим показателем для характеристики состояния здоровья и болезни организма.

32