ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Субстратные циклы

В теоретическом приложении к лабораторной работе № 4 упоминалось, что одна из необратимых реакций гликолиза, а именно, реакция, катализируемая фосфофруктокиназой, находится под положительным аллостерическим контролем со стороны АМР. Оказалось, что в условиях низкого энергетического заряда клетки АМР может влиять на эффективность фосфофруктокиназы еще одним способом. В клетках был обнаружен фермент фруктозо- 1,6-дифосфатаза, который осуществляет также необратимую реакцию гид-

ролиза фруктозо-1,6-дифосфата до фруктозо-6-фосфата и неорганического

фосфата (Рi).

Пара реакций, таких как фосфорилирование фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат и гидролиз последнего до фруктозо-6-фосфата получила название субстратного цикла. К субстратным циклам относят также синтез и распад гликогена, превращение фосфоенолпирувата в пируват и обратное превращение пирувата в фосфоенолпируват через промежуточное образование щавелевоуксусной и яблочной кислот (процесс частично осуществляется в митохондриях), а также фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6- фосфат и гидролиз глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы.

Наличие таких циклов долгое время объясняли несовершенством метаболической регуляции и, по этой причине, субстратные циклы иногда называли бессмысленными или холостыми циклами. Однако в настоящее время, наиболее вероятным представляется, что субстратные циклы имеют определенное биологическое значение. Рассмотрим следующий пример. В результате функционирования двух ферментов – фосфофруктокиназы и фруктозо-1,6- дифосфатазы цикл, по существу, ничем не завершается, кроме расщепления АТР до ADP и Pi:

Нетто выражение для двух этих реакций представляет собой гидролиз

АТР:

56

Циклы такого типа обычно не приводят к гибельно быстрой потере клеткой АТР именно из-за четкого контроля метаболических процессов. В принципе, в каждый данный момент времени полностью активируется только один из двух ферментов субстратного цикла. В зависимости от метаболического состояния клетки может активно протекать процесс распада при невысоком уровне биосинтеза или активный процесс биосинтеза при слабом распаде. Таким образом, одна из возможностей состоит в том, что субстрат-

ные циклы амплифицируют биологические сигналы. Допустим, что скорость превращения фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат составляет 100 условных единиц, а скорость обратного процесса равняется 90 таких же условных единиц. При этом чистый выход от функционирования двух реакций составляет 10 условных единиц.

Примем, что аллостерический эффектор (АМР) повышает скорость прямой реакции фруктозо-6-фосфат → фруктозо-1,6-дифосфат на 20% (т.е. до 120 условных единиц) и, реципрокно, снижает скорость обратной реакции фруктозо-1,6-дифосфат → фруктозо-6-фосфат также на 20% (до 72 условных единиц). В таком случае новый чистый выход фруктозо-1,6-дифосфата теперь составит уже 48 условных единиц.

Таким образом, изменение всего лишь на 20% скоростей противоположно направленных реакций приводит к повышению чистого выхода всего субстратного цикла с образованием фруктозо-1,6-дифосфата на 480%.

Другая потенциальная биологическая роль субстратных циклов состоит в том, чтобы генерировать тепло, продуцируемое при гидролизе АТР. Отсюда следует, что если в норме субстратные циклы находятся под строгим контролем, то при патологических состояниях они, по-видимому, могут служить источником неконтролируемого выделения тепла.

57

У пациентов со злокачественной гипертермией многие химические агенты, особенно широко используемый анестетик общего назначения – галотан, вызывают опасное повышение температуры тела, метаболический и респираторный ацидозы, гиперкалиемию и отвердение мышц. Во многих случаях даже чрезвычайные меры не могут спасти больного от быстрой смерти. Это генетически обусловленное нарушение терморегуляции (в присутствии отдельных химических агентов) встречается у одного из 15 000 детей и одного из 50 000 – 100 000 взрослых. Заболевание наследуется, как доминантный признак. Часто смерть наступает у чувствительных к галотану пациентов в первое же время после применения анестетика. Начало повышения температуры происходит буквально в пределах нескольких минут, поэтому гипертермию необходимо уметь распознавать немедленно. В настоящее время при злокачественной гипертермии больного сразу же помещают в лед и предпринимают попытки устранения ацидоза посредством введения современного препарата – дантролена.

Биохимические основы гипертермии до сегодняшнего дня очень плохо изучены. Схожий, если не идентичный феномен обнаружен у свиней некоторых пород. Свиньи этих пород плохо реагируют на стресс и, в момент стресса, у них происходит резкое увеличение температуры, сопровождаемое судорогами мышц и сильным снижением в мышцах содержания АТР. Интересной особенностью свиней с такой реакцией на стресс является высокая чувствительность к галотану, которая наблюдается у людей со злокачественной гипертермией. Мясо свиней, погибших от указанного синдрома бледное, водянистое с очень низким значением рН (т.е. практически «замаринованное»).

Полагают, что именно мышечная ткань поражается в первую очередь как при злокачественной гипертермии у людей, так и при стрессовом синдроме у свиней. В ответ на действие галотана скелетная мускулатура становится твердой, интенсивно генерирует тепло и молочную кислоту. Как считают некоторые исследователи, за опасное увеличение температуры ответственна гликолитическая активность, а также неконтролируемое функционирование субстратного цикла, ответственного, в данном случае, за ускоренный гидролиз АТР:

Действительно, как было показано, галотан ускоряет субстратный цикл у экспериментальных свиней на уровне фосфофруктокиназа/фруктозо-1,6-

дифосфатаза. Возможно, что у пациентов со злокачественной гипертермией имеет место дефект одного из ферментов цикла в отношении взаимодействия с молекулами аллостерического контроля. Имеются также доказатель-

ства того, что при злокачественной гипертермии саркоплазматический ретикулум клеток скелетных мышц характеризуется нарушениями структуры кальциевых каналов, а анестетик выступает в роли триггера, который запус-

58

кает неадекватное высвобождение Ca+2 из саркоплазматического ретикулума. В свою очередь высвобождение Ca+2 может приводить к неконтролируемой стимуляции ряда теплопродуцирующих процессов таких, как активация мио- зин-АТР-азы, повышение эффективности гликогенолиза и гликолиза, а также циклического поглощения и выброса Ca+2 митохондриями и саркоплазматическим ретикулумом клеток скелетных мышц (Mitchell G., Heffron J.J.A., van Rensberg A.J.J., A halothane-induced biochemical defect in muscle of normal and malignant hyperthermia-susceptible land-race pigs, Anesth. Analg., 1980, 59, 250-263, Nelson T.E., Sarcoplasmic reticulum function in malignant hyperthermia,

Cell Calcium, 1988, 9, 257-269 и Michelson J.R., Gallant E.M., Litterer L.A., Johnson K.M., Rempel W.E., Louis C.F., Abnormal sarcoplasmic reticulum ryanodine receptors in malignant hyperthermia, J. Biol. Chem., 1989, 263, 93109321).

Другим известным субстратным циклом является пара реакций, ката-

лизируемых глюкокиназой и глюкозо-6-фосфатазой:

Как видно из приведенной выше схемы, совместное действие глюкокиназы и глюкозо-6-фосфатазы поддерживает функционирование субстратного цикла, также обеспечивающего гидролиз АТР без совершения работы. Вместе с тем и этот «бессмысленный» цикл характеризуется существенным биологическим значением. Оказывается, что в тех случаях, когда концентрация глюкозы в крови составляет примерно 5 mM, активность глюкокиназы почти полностью уравновешена противоположной активностью глюкозо-6-фосфатазы. Этот цикл некоторым образом понижает уровень АТР, но в сочетании с процессом глюконеогенеза отвечает за «буферное» действие печени в отношении поддержания постоянной концентрации глюкозы в крови. Более того, этот цикл представляет собой защитный механизм, оберегающий глюкокиназу от полного связывания всего неорганического фосфата.

К субстратным циклам можно отнести также еще одну пару реакций, в которых участвуют фосфорилированные сахара. Эти реакции обеспечивают синтез фруктозо-2,6-дифосфата из фруктозо-6-фосфата, с одной стороны, и гидролиз фруктозо-2,6- дифосфата снова до фруктозо-6-фосфата, с другой стороны:

59

Фруктозо-2,6-дифосфат, вероятно, присутствует в клетках всех тканей, однако его роль в регуляции гликолиза лучше всего изучена в печени. Роль фруктозо-2,6-дифосфата, подобно роли АМР, сводится к функционированию в качестве положительного аллостерического эффектора фосфофруктокиназы и отрицательного аллостерического эффектора фруктозо-1,6- дифосфатазы.

Действительно, в отсутствие фруктозо-2,6-дифосфата эффективность гликолитического пути очень низка вследствие низкой концентрации фрук- тозо-1,6-дифосфата. Фруктозо-2,6-дифосфат принимает непосред-ственное участие в гормональной регуляции эффективности гликолиза в печени. При этом, образующийся в α-клетках поджелудочной железы глюкагон связывается с глюкагоновыми рецепторами, расположенными на внешней стороне плазматических мембран гепатоцитов. Связывание глюкагона с рецепторами инициирует продукцию с-АМР под действием аденилатциклазы. В свою очередь, с-АМР обеспечивает снижение уровня фруктозо-2,6-дифосфата (рис. 5.1).

Рис. 5.1 Схема функционирования механизма, ответственного за ингибирование гликолиза в печени под действием глюкагона. Снижение концентрации фруктозо-2,6-дифосфата приводит к уменьшению активности фосфофруктокиназы и увеличению активности фруктозо-1,6-дифосфатазы, что обеспечивает ингибирование гликолиза.

Снижение же концентрации фруктозо-2,6-дифосфата в клетке приводит к уменьшению активности фосфофруктокиназы и, одновременно, к увеличению активности фруктозо-1,6-дифосфатазы (Claus T.H., et al. The role of fruc-

60