Вірусологія

правильного моношару і входять у період уповільненого росту чи спокою (стаціонарна фаза чи фаза плато). Якщо на даному етапі культивування не відбудеться перенесення клітин на свіже поживне середовище, то наступає фаза старіння та загибелі клітин. Розмножуючись, клітини розміщуються на поверхні скла і при повному його покритті в один шар контактують одна з одною і перестають ділитися (спостерігається явище контактного гальмування) (Рис 2.19). На склі формується шар товщиною в одну клітинну, тому такі культури клітин називають одношаровими чи моношаровими.

мл	1200
тис/
,	1000
клітин
	800
кількість	600
	400
	200
	0
	0	12	24	36	48	60	72	84	96
					час культивування, год

Рис. 2.21. Крива росту клітин у культурі: 1 – лаг - фаза;

2 – фаза експоненційного росту (логарифмічна фаза); 3 – стаціонарна фаза;

4 – фаза відмирання клітин.

Як правило, моношар формується через 3-5 діб. Швидкість його формування залежить від виду тканин, віку донора, якості поживного середовища, посівної концентрації клітин та інших факторів.

Поживне середовище замінюють по мірі його забруднення продуктами життєдіяльності клітин. Моношар зберігає свою життєздатність впродовж 7-21 діб (у залежності від виду клітин та поживного середовища).

Таблиця 2.10.

101

Чутливість первинних культур клітин до вірусів людини

Походження культури клітин			Віруси
Нирка ембріону людини	Аденовіруси		(1-33), ріновіруси (1-55),
	вірус кору
	Поліовіруси (1-3), ЕСНО (1-9, 11-27,
	29-33), Коксакі А (2-4,7-11,13-18,20-24)
	і В (1-6), грипу А і В, парагрипу (1,2,4),
Нирка макаки-резус	кору, паротиту, реовіруси (1-3),
	аденовіруси		(1-18,	20,	25-33),
	ротавіруси, цитомегаловірус, вірус
	гепатиту А.
Нирка африканської зеленої	Вірус вісповакцини, поліовіруси (1-3),
	ротавіруси,		арбовіруси		(група
мавпи	кліщового енцефаліту), тогавіруси
	Віруси	східного,		західного		та
	венесуельского				кінського
Фібробласти курячих ембріонів	енцефаломієліту, вірус лісу Семлікі,
	Синдбіс, Охотський, віруси вісни,
	хвороби Ньюкасла
	Аденовіруси		(1-33),		реовіруси,
Нирка ембріону свині	поліовіруси (1-3), вірус грипу А та В,
	вісповакцини

Лінії диплоїдних клітин (напівперещеплювані лінії клітин) – це клітинні лінії, в яких, у крайньому випадку, 75% клітин мають каріотип нормальних клітин вихідного типу; такі культури клітин, трансплантовані хом'ячкам, не проявляють онкогенної активності. Диплоїдний набір хромосом не завжди еквівалентний диплоїдному каріотипу, оскільки існують умови, при яких клітина може втрачати один тип хромосом і набувати інший. Це значить, що каріотип клітини змінився, а диплоїдний набір хромосом зберігся. Такі клітини слід вважати “псевдодиплоїдними”. Диплоїдні культури можуть пасуватися багаторазово (диплоїдні штами), витримуючи до 80 популяційних поділів. Слід зазначити, що культури диплоїдних клітин дуже вибагливі до умов культивування, тому їх рідко використовують у вірусологічній практиці. Часто диплоїдні клітинні культури називають напівперещеплюваними культурами клітин.

102

Приклади диплоїдних культур клітин – WIТ-38 (фібробласти легень людини), MRC-5 (диплоїдні фібробласти людини), ТМ 4 (лінія клітин тестикулярного епітелію миші) та ін.

Увипадку, коли клітинна лінія має менш ніж 75% клітин із диплоїдним набором хромосом, говорять про лінію гетеродиплоїдних клітин. Цей термін не означає, що клітини злоякісні чи здатні до необмеженого росту.

Постійна (безперервна, перещеплювана) клітинна лінія –

складається із клітин одного типу, що здатні субкультивуватися поза організмом протягом необмеженого числа пасажів. Постійні клітинні лінії отримують із пухлинних або нормальних тканин людини або тварин, які мають змінений (трансформований) каріотип (табл. 2.11.). Використання постійних культур клітин у вірусологічній практиці має певні переваги в порівнянні з первинними та диплоїдними культурами клітин (табл. 2.12.).

На рівні сучасних знань про поведінку клітин, що культивуються in vitro, неможливо визначити точку, коли культура стає стабільною, тобто набуває здатності рости необмежено довго. На основі досліду з фібробластоподібними клітинами людини встановлено, що культура повинна субкультивуватися не менш ніж 70 разів, з інтервалом у три доби, перш ніж її можна вважати безперервною лінією клітин.

Упостійних культурах клітин клітини трансформовані. Під трансформацією клітин розуміють незворотні клітинні зміни, які характеризуються зміною ростових властивостей клітин, що культивуються. Трансформація робить клітини „безсмертними” і менш залежними від поживних та “геометричних” факторів росту. Зміни ростових властивостей пов’язані з порушенням транспорту через клітинну мембрану і є однією з адаптивних властивостей, які дозволяють клітинам розмножуватися в умовах, несприятливих для нетрансформованих батьківських клітин. При цьому клітинні мембрани втрачають поверхневий білок (250 кДа) і дещо змінюють антигенні властивості.

Спонтанна трансформація культур клітин нормальних тканин

євідносно рідкісним явищем. Частоту таких трансформацій можна збільшити, оброблюючи клітини мутагенами чи деякими вірусами (наприклад, SV-40, вірус Епштейна –Барр та ін.).

Трансформовані клітини можуть утворювати пухлини у імунологічно толерантних тварин. За цією ознакою трансформація інколи неправомірно прирівнюється до злоякісних змін.

103

На ранніх стадіях культивування клітини залишаються еуплоїдними, тобто мають „правильний” диплоїдний набір хромосом, а пізніше вони стають анеуплоїдними. Іноді деякі з цих анеуплоїдних клітин виживають і продовжують розмножуватися, що призводить до встановлення клітинного штаму. Всі постійні клітинні лінії, на відміну від культур нормальних клітин з обмеженим терміном життя, є зміненими за рядом ознак, головною з яких є “безсмертя”. Здатність до необмежено тривалого розмноження в культурі, як правило, пов’язана з анеуплоїдним каріотипом. Для деяких клітинних ліній (наприклад, ВНК-21), які хоч і мають диплоїдний набір хромосом, каріотип змінений. Інші критерії трансформації (онкогенність, контактне гальмування, вимоги до середовища) проявляються у різних ліній неоднаково. Лінії клітин, які отримані з пухлинних тканин (тобто трансформовані в організмі), часто зберігають спеціалізовані функції (наприклад, здатність продукувати деякі ферменти) протягом більш тривалого часу, ніж клітини, трансформовані в культурі різними методами. Частота отримання постійних ліній у різних видів ссавців неоднакова. Так, наприклад, клітини мишей піддаються спонтанній мутації частіше, ніж клітини людини чи інших ссавців. Указана різниця, можливо, пов’язана з неоднаковою стабільністю каріотипу різних видів тварин.

При взаємодії вірусів з клітинами культури тканин спостерігаються різні зміни, обумовлені рядом факторів. Серед них велике значення має ступінь чутливості клітин культури до вірусу та умови середовища. Постіні культури відрізняються за ступенем своєї чутливості до вірусів. Як правило, для культивування певних вірусів підбирають такі культури, в яких зміни під впливом вірусної інфекції є найбільш виразними (табл.2.13).

Таблиця 2.11

Характеристика деяких із відомих клітинних ліній

Позна	Походження			Ознаки
				Ріст у	Ефективніс
чення	Вид	Тканина	Морфолог			Плоїдніст
			ія	суспенз	ть висіву,	ь
				ії	%
ЗТЗ	Миша,	Ендотелі	фібробласт	-	50	Анеуплої
	n=20	й	и			дні
			104

L	-”-	Сполучн	«	+	90	«
		а
		тканина			95
СНО/К	Китайсь	Яєчник	Епітелій	+		Псевдоди
Х	кий					плоїдні
	хом’ячо
	к, n=11				20
ВНК	Золотис	Нирка	Фібробласт	+		Диплоїдні
21	тий		и
	хом’ячо
	к				Незначна (<
BSC	Макака-	-”-	Епітелій	-		-”-
	резус.				20)
	n=21				0
МРS	Миша,	Мієлома	Лімфоїдна	+		Анеуплої
	n=20		тканина		0	дні
RPH	Жаба,	Яйцекліт	Епітелій	-		Гаплоїдні
	n=13	ини			95
HeLa	Людина	Пухлина	Епітелій	+		Анеуплої
	, n=13	шийки				дні
		матки

Приклади постійних культур клітин: SV-28 – постійна культура нирки новонародженого хом’яка, трансформована вірусом SV-40; MCF–7 -карцинома молочної залози людини; HeLa

– карцинома шийки матки людини (рис.2.22.b.); Hep–2 – карцинома гортані людини; КВ – карцинома ротової порожнини людини; RH – нирка ембріону людини; Vero – нирка зеленої мавпи; L - мишачі фібробласти (рис. 2.22.a.); C-1300 – нейрабластома миші; СНЕВ - нирка ембірона свині та ін.

Таблиця 2.12

Переваги та недоліки використання постійних культур клітин

Переваги постійних КК			Недоліки постійних КК
Здатність	до	необмеженого	Схильність	до	злоякісного
розмноження			перетворення (малігнізації)
Простота	отримання→економія		Швидке зниження		чутливості до
праці та матеріальних затрат			вірусів, у порівнянні з первинними
		105

Можливість попередньої перевірки КК на присутність латентної вірусної інфекції та сторонньої мікрофлори

Забезпечення стандартних умов для розмноження вірусів, в порівнянні з первинними КК (що являють собою популяцію змішаних типів клітин)

Широкий спектр чутливості до вірусів, в порівнянні з відповідними первинними КК

a b

Рис.2.22. Постійні культури клітин: a – мишачі фібробласти;

b - HeLa

Таблиця 2.13 Чутливість постійних клітинних культур до вірусів

Назва культури	Походження культури		Віруси
клітин	клітин
			Аденовіруси	(1-33),
			респіраторно-
	Карцинома	шийки	синцитіальний	вірус,
HeLa			поліовірус (1-3), ЕСНО
	матки жінки		(1-9, 11-27, 29,33),
			Коксакі А (2,3, 7, 18,
			21)
Hep-2	Карцинома	гортані	-„-
	106

	людини
	Карцинома	ротової	Аденовіруси,
KB			поліовіруси			(1),
	порожнини людини		арбовіруси
			Аденовіруси			(1-33),
RH	Нирка	ембріона	респіраторно-
	людини		синцитіальний			вірус,
			віруси парагрипу
			Аденовіруси,
			респіраторно-
L132	Легеня	ембріона	синцитіальний			вірус,
	людини		коронавіруси,
			поліовіруси			(1-3),
			ЕСНО
			Коксакі		В	(1-6),
			поліовіруси			(1-3),
			арбовіруси,		реовіруси,
Vero	Нирка зеленої мавпи		віруси	везикулярного
			стоматиту			(ВВС),
			вісповакцини,			простого
			герпесу (1-2)
L929	Фібробласти миші		Арбовіруси, ВВС
			Вірус	сказу,		простого
BHK-21	Нирка	сірійського	герпесу,		аденовіруси
	хом’яка		(25),	реовіруси (3),
			ВВС
СНЕВ	Нирка ембріона свині		Арбовіруси			(група
			кліщового енцефаліту)
			Віруси грипу типу а і
			В, ВВС, вісповакцини,
MDCK	Нирка собаки		Коксакі		В	(5),
			реовіруси			(2,3),
			аденовіруси (4,5)

Суспензійні культури клітин

Метод культивування клітин у суспензії широко ввійшов у вірусологічну практику у зв’язку з його перспективністю при накопиченні великої кількості клітин. Цей метод затвердив себе у

107

виробництві ферментів та інших продуктів життєдіяльності бактеріальних клітин, проте адаптація клітин ссавців до суспензійних умов має певні труднощі, так як клітини тварин у порівнянні з бактеріальними більш чутливі до фізичних факторів, легше осаджуються, досить вимогливі до складу поживних середовищ і повільніше розмножуються.

Розповсюдженню методу суспензійного культивування сприяло введення ферментативного диспергування тканин тварин і особливо виведення постійних клітинних ліній, які виявилися здатними до необмежено тривалого пасування у суспензійному стані.

Переваги методу культивування клітин у суспензіях:

-висока однорідність суспензій;

-можливість підтримання клітин у логарифмічній фазі росту;

-перспективи математичного моделювання процесів клітинного росту в залежності від впливу факторів зовнішнього середовища;

-зручність багатократного дослідження фізіологічного стану культури клітин у суспензії;

-висока економічність методу.

У зв’язку з цим великого значення набули дослідження штамів клітин, які здатні до тривалого розмноження в суспензійних умовах культивування. Так, були адаптовані багато постійних культур клітин до розмноження в цих умовах (ВНК-21, Hep-2 та ін.). Крім того, потрібно зазначити, що кровотворні клітини краще ростуть у суспензійній культурі.

Запропоновано декілька підходів, які дозволяють культивувати клітини у стані завису: batch-культури (розмноження в суспензії забезпечується безперервним перемішуванням завису в умовах постійності середовища), проточні системи (хемостати, турбідостати), застосування мікроносіїв (сефадекс, силікагель, цитолар та ін.). Культивування на мікроносіях в наш час є досить популярним методом, оскільки дозволяє вирощувати залежні від прикріплення до твердого субстрату клітини (первинні, субкультури, диплоїдні) в умовах суспензії.

Зберігання культур клітин

108

Для попередження забруднення клітинних культур клітинами інших типів (міжвидове перехресне забруднення), патогенними бактеріями й грибами, а також для попередження виникнення неконтролюємих генетичних змін клітин постає необхідність у їх консервації. При консервації клітин їх, в основному, зберігають в умовах знижених температур від 4 0С до – 78 0С (при зберіганні в умовах сухого льоду) та – 1960 С (при зберіганні в умовах рідкого азоту). При зберіганні клітин в умовах низьких температур може відбуватися їх ушкодження при заморожуванні та відтаванні. Ці ушкодження клітин обумовлені появою внутрішньоклітинних кристалів льоду та осмотичними ефектами. Додавання кріопротекторів (диметилсульфоксид, етиленгліколь, гліцерин та ін.), а також підбір оптимальних швидкостей заморожування та відтавання зводять ушкодження клітин до мінімуму.

Умови культивування клітин in vitro

Перенесення клітин цілісного організму в штучні умови життя припиняє їх існування як одного з чисельних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніш входили. При цьому клітини виходять із під контролю нейрогуморальних факторів організму і набувають таких особливостей, які залежать від самого факту їх існування в штучних умовах. Це проявляється, насамперед, в збільшенні швидкості розмноження клітин у культурі порівняно з їх розмноженням в організмі тварини .

Культивування клітин in vitro залежить від наступних факторів:

1.Дотримання стерильності, яка необхідна для забезпечення захисту культур від контамінації їх бактеріями, грибами, вірусами та клітинами інших культур. Стерильними повинні бути приміщення, в яких відбувається маніпуляція з культурами клітин, посуд, інструменти, поживні середовища, вихідна тканина та ін.

2.Щільності популяції клітин. При досягненні певної межі щільності популяції клітин у певному об’ємі подальше розмноження клітин припиняється. Це стосується як клітин, що схильні до контактного гальмування, так і гетероплоїдних клітин, що формують багатошарові пласти на склі. Щільність

популяції клітин в постійних культурах у суспензії не повинна перевищувати 5 х 106 кл/мл. Для перфузійних клітин в

109

хемостатах, де періодично здійснюється подача поживного середовища й видалення продуктів метаболізму, диплоїдні, псевдодиплоїдні та гетеродиплоїдні клітинні лінії утворюють щільні популяції (2 х 109 кл/мл) та багатошарові культури.

3.Вмісту поживного середовища - неорганічних речовин,

вуглеводів, білків, амінокислот, гормонів, вітамінів та інших біологічно-активних речовин, газового середовища. Так, двоокис вуглеця є продуктом обміну і відразу зв’язується з катіонами середовища. Іон двоокису вуглеця виконує функцію буфера у ібльшості поживних середовищ. Для підримання певного тиску двоокису в атмосфері її додатково вводять в

сосуди для культивування чи закривають їх герметично і той двоокис, що утворився в процесі культивування, зберігається.

4.рН середовища. Для оптимального росту більшість клітин in vitro оптимум рН біологічних рідин має бути між 7,2-7,6 та небажано відхилення рН від меж 6,8-7,8.

5.Температури культивування. Для більшості клітин ссавців та птахів оптимальною є температура 37-38,5 ºС. Якщо температура підвищується, це згубно діє на клітини, і при температурі 45 ºС клітини гинуть протягом однієї години.епітеліальні клітини шкіри та інших тканин ембірону людини краще ростуть при температурі 35-36 ºС. Більшість клітин риб культивують при температурі не вище 20 ºС. Тканини амфібій також краще виживають при низькій температурі.

6.Осмотичного тиск. Для клітин ссавців оптимальним при 37-38 ºС є тиск 7,6 атм, хоча клітин можуть переносити значні коливання тиску, якщо ці коливання відбуваються не дуже швидко. Осмотичний тиск визанчається головним чином іонами хлористого натрія, інші іони також суттєво впливають на осмотичний тиск, оскільки він значно збільшується при підвищенні концентрації глюкози.

Поживні середовища

Розрізняють природні та штучні (синтетичні та напівсинтетичні) поживні середовища. Природні середовища складаються із суміші сольового розчину (наприклад, розчину Хенкса, Ерла), сироватки крові, тканинного (ембріонального) екстракту, коров’ячої амніотичної рідини та інших компонентів.

110