Вірусологія

(мозку, легень, серця, печінки, селезінки та нирок), враховуючи їх форму, колір, консистенцію, стан поверхні, наявність чи відсутність крововиливів;

-висновки про тропізм вірусу, ураженість органів.

2.Замалювати в альбоми:

-схему кольорового маркування лабораторних тварин (за методом Тойффеля; з допомогою розчинів фуксину та пікринової кислоти);

-методи ураження лабораторних тварин (інтраназальний, інтравенозний, інтрамускулярний, інтраперітонеальний);

-схему розтину лабораторних тварин за Вагенером.

Контрольні запитання:

1.З якими цілями використовують лабораторних тварин у вірусологічних дослідженнях?

2.Які недоліки застосування лабораторних тварин у порівнянні з іншими модельними об’єктами вам відомі?

3.Чому у конкретному вірусологічному експерименті використовується не одна лабораторна тварина, а не менше трьох?

4.Що таке модельні об’єкти? Які модельні об’єкти ви можете назвати?

5.Чим індикація вірусу у патологічному матеріалі відрізняється від ідентифікації збудника?

6.Для чого здійснюється титрування вірусного матеріалу?

7.Чим пояснюється різноманіття видів лабораторних тварин?

8.Яким вимогам повинні відповідати тварини, яких відбирають для вірусологічних досліджень?

9.Дати характеристику умовам утримання лабораторних тварин.

10.Що таке канібалізм і які існують заходи його профілактики?

11.Охарактеризувати карантин, його суть, причини, заходи реалізації.

12.Етапи роботи з тваринами при проведенні вірусологічного експерименту.

13.Які прийоми маркування лабораторних тварин знайшли використання у вірусологічних дослідженнях?

14.Для чого і яким чином проводять наркоз лабораторних тварин?

15.Що таке тропізм вірусу? На які категорії віруси поділяються за тропізмом?

81

16.Який існує зв’язок між тропізмом вірусу, методом ураження тварини та досліджуваним патологічним матеріалом?

17.Які методи експериментального зараження лабораторних тварин вам відомі?

18.Чим регламентується вибір методу ураження тварини?

19.Як і для чого здійснюється контроль за зараженими тваринами?

20.Охарактеризувати види патологічного матеріалу, який одержують від заражених лабораторних тварин.

21.Що таке сліпий пасаж?

22.Які ознаки розмноження вірусу в організмі заражених лабораторних тварин відомі?

23.Які існують способи одержання крові у лабораторних тварин?

24.Чим відрізняється плазма крові від сироватки крові?

25.Охарактеризувати етапи одержання еритроцитів крові лабораторних тварин.

26.Дати характеристику способам евтаназії лабораторних тварин.

27.Охарактеризувати послідовність та особливості зовнішнього огляду трупа загиблої лабораторної тварини перед його розтином.

28.Техніка розтину трупа лабораторної тварини та одержання секційного матеріалу.

29.На чому заснований вибір певного органу, який вилучають при розтині з організму зараженої лабораторної тварини в якості вірусовмісного матеріалу?

30.Які види патологічного матеріалу можуть бути відібрані від лабораторної тварини (у ході експерименту, а також після евтаназії тварини)?

31.Охарактеризувати застережні заходи, що застосовуються при роботі з інфікованими лабораторними тваринами.

32.Неінфікована тварина у віварії демонструє ознаки хвороби невстановленого походження. Ваші дії?

33.До вірусологічного експерименту були відібрані десять пацюків. Перед їх зараженням було помічено, що три пацюки ведуть себе нетипово і відмовляються від їжі. Ваші дії?

34.Що є необхідною умовою вдалого інтраназального ураження лабораторних тварин вірусом грипу типу А?

82

35.Який спосіб зараження може бути використаний при інфікуванні лабораторних тварин вірусом простого герпесу і чому?

36.При імунізації тварини був внутрішньовенно введений повний ад’ювант Фрейнда. Як це може вплинути на швидкість вироблення імунітету та його стійкість?

37.Необхідно отримати 150 мл специфічної поліклональної антисироватки до вірусу тютюнової мозаїки. Яку лабораторну тварину доцільніше використати у даному випадку?

38.Хворіє поголів’я свиней. Ознаки хвороби: втрата орієнтації у просторі, відмова від їжі, швидка втома. Який патологічний матеріал має бути зібраний від забитої тварини для аналізу і чому?

39.При розтині тварини було помічено, що внутрішні органи грудної порожнини мають численні крововиливи. Який висновок можна зробити про тропізм та природний спосіб передачі невідомого збудника?

40.Необхідно зробити тотальний забір крові для виділення еритроцитів у піддослідного кроля. Вкажіть всі етапи цієї процедури.

Література:

Дроздов С.Г., Гарин Н.С., Джиндоян Л.С., Тарасенко В.М. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях. –М., 1987.

Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария В.А. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. –К., 1974.

Каришева А.С., Сюрин В.Н. Руководство по практической вирусологии (справочное пособие). –Кишинев: «Штиинца», 1980. Лоскутова З.Ф. Виварий. –М.: Медицина, 1980.

Любина А.Я., Неменова Ю.М., Полеес М.Э., Чернобельская Г.М. Руководство к практическим занятиям по технике лабораторных работ. –М., 1988.

Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных. Справочное издание / под ред. Н.И. Архипова. –М., 1984.

Посібник з медичної вірусології / під ред. В.М. Гиріна. –К.:

Здоров’я, 1995. -367 с.

Практикум із загальної вірусології / за ред. А.Л. Бойка. –К.:

83

Видавничий центр „Київський університет”, 2000. -269 с. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. –М., 1973.

Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник. –М., 1986.

Топчий М.К., Корнюшенко Н.П. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. –К., 1967.

Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. –М.: Агропромиздат, 1989. -287 с. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. „Биология вирусов животных”. т.1. –М.: Мир, 1977. -447 с. Luckey T.D. Introduction to gnotobiology // Proceedings of the IX International Congress for Microbiology, Moscow, 1967.

84

Тема 2. Курячі ембріони та їх використання у вірусології Зміст

Теоретична частина Будова курячого ембріону

Підготовка курячих ембріонів до ураження Методи експериментального ураження курячих ембріонів Ознаки розмноження вірусу в курячому ембріоні

Розтин курячого ембріону та отримання вірусовмісного препарату Практична частина Мета заняття Матеріальне забезпечення Хід роботи Контрольні завдання Контрольні запитання

Завдання для самостійної роботи студентів Література

Вступ

Метод культивування вірусів на курячих ембріонах стали широко застосовувати після того, як Вудруфф та Гудпасчур в 1931р. описали зараження хоріоналантоїсної оболонки курячого ембріону вірусом курячої віспи. В 40-х роках з’явилось багато робіт по культивуванню різноманітних вірусів - віспи, вісповакцини, простого герпесу, лихоманки долини Ріфт, весняно - літнього енцефаліту, Омської геморагічної лихоманки та інших. Було відмічено, що існує деяка вибірковість у вірусів до тоієї чи іншої тканини. Віруси віспи добре розмножувались на хоріоналантоїсній оболонці, вірус паротиту - в амніоні, вірус грипу - в амніоні та в алантоїсній порожнині. Сьогодні майже в усіх вірусологічних лабораторіях проводять роботу на курячих ембріонах, тому що цю експериментальну модель зручно використовувати для:

-виявлення вірусу в патологічному матеріалі;

-первинного виділення вірусу;

-культивування, зберігання та накопичення вірусу в лабораторних умовах;

-титрування вірусів;

-як тест-об’єкт для реакції нейтралізації;

-визначення ефективності противірусних препаратів.

85

Будова курячого ембріону

Куряче яйце знаходиться в шкаралупі, через пори якої здійснюється газообмін. Під шкаралупою лежить підшкаралупна оболонка. У результаті запліднення в ході дроблення яйцеклітини утворюється три зародкових шари: ектодерма, мезодерма та ентодерма, з яких розвиваються тканини та органи ембріону. Разом з розвитком плоду утворюються екстраембріональні оболонки амніон та хоріон (або серозна оболонка ). Амніон знаходиться безпосередньо біля зародку. Це мішок з рідиною, в якому розташоване тіло ембріону. Амніотична рідина на початку розвитку являє собою фізіологічний розчин солей, який надалі збагачується білком. Кількість амніотичної рідини на 10-11 день розвитку ембріону становить приблизно 1 мл.

Хоріон знаходиться безпосередньо під підшкаралупною оболонкою. На ранній стадії розвитку ембріону з нього утворюється виріст - алантоїс, що є порожнинним органом. У процесі розвитку алантоїс проходить між амніоном та хоріоном і оточує зародок разом з жовтком. Алантоїс розвивається дуже швидко, його максимальний ріст відбувається з 4 -го по 13 -й день розвитку. Оболонка алантоїсу частково зрощується з хоріоном, утворюючи хоріоналатоїсну оболонку (рис. 2.16 ). Це орган дихання зародку, тут розміщені кровоносні та лімфатичні судини. В останні дні розвитку ембріону хоріоналантоїсна оболонка атрофується, повітря поступає через пори шкаралупи і курча починає дихати легенями.

Алантоїсна порожнина - це орган виділення. На початку розвитку він заповнений прозорим фізіологічним розчином, а надалі збагачується уратами та речовинами, які містять азот та фосфор. З 12-13 дня розвитку рідина стає каламутною, а при охолодженні з неї випадає осад сечової кислоти. Кількість алантоїсної рідини досягає 6-8 мл на 11-13 день розвитку і поступово зменшується .

Ембріональні тканини з великою кількістю клітин, що швидко діляться, з високим обміном речовин є дуже сприятливим середовищем для культивування вірусів. Особливо це стосується оболонок ембріону, які багаті клітинами зародкового епітелію. Суттєву роль для розмноження вірусів відіграє жовткова оболонка, що оточує жовток. Він є органом живлення і під час розвитку поступово зменшується. У період з 5-го по 12-й день інкубації курячі ембріони можуть бути використані для ураження вірусами.

86

Ураження в ту чи іншу частини ембріону проводяться в період її максимального розвитку, коли кількість чутливих клітин найбільша (табл. 2.9).

Підготовка курячих ембріонів до ураження.

Ембріони доставляють із інкубатора. У лабораторії ембріони інкубуються в термостаті при температурі 370С і вологості 60-70%. Ембріони розміщують повітряними камерами вверх у штативі. Підготовка курячих ембріонів до ураження включає овоскопування та дезінфекцію шкарлупи, а також відповідну підготовку робочого місця. При овоскопуванні на шкарлупі олівцем помічають: межі повітряної камери, місце розміщення зародка та ділянку безсудинної зони розміром 0,5х0,5 см. Ці відмітки служать орієнтиром при виборі місця введення вірусовмісного матеріалу. Місця ін'єкції обробляють йодованим спиртом.

Методи експериментального ураження курячих ембріонів.

Існує кілька методів ураження ембріонів. Найбільш часто використовують ураження в алантоїсну порожнину та в хоріоналантоїсну оболонку, рідше – в амніотичну порожнину та жовтковий мішок і зовсім рідко - в тіло зародка та кровоносні судини хоріоналантоїсної оболонки. Вибір методу залежить від тропізму вірусу, а також цілі ураження. При будь-якому методі ураження вводять 0,1-0,2 мл інфекційного матеріалу.

Ураження в алантоїсну порожнину. При ураженні цим методом добре розмножуються віруси грипу, хвороби Ньюкасла, ринопневмонії коней, везикулярного стоматиту та інші. Існує кілька варіантів методу.

Ембріон фіксують вертикально тупим кінцем вверх. У шкаралупі на 5-6 мм вище межі повітряної камери роблять отвір діаметром 1 мм. Голку вводять паралельно повздовжній вісі на глибину 10-12 мм. Після ін’єкції вірусовмісного матеріалу голку виймають, а отвір в шкарлупі закривають краплею розплавленого стерильного парафіну.

Інший варіант методу полягає в тому, що зроблений у шкарлупі отвір над повітряною камерою використовують лише для виходу частини повітря. Отвір для самого ураження роблять на ділянці безсосудистої зони хоріоналантоїсної оболонки з боку зародка. Голку вводять на глибину 2-3 мм. Вводять вірусовмісну рідину об’ємом 0,1-0,2 мл і закривають отвір парафіном.

87

Ураження в хоріоналантоїсну оболонку. Цей метод ураження курячих ембріонів використовують частіше для культивування епітеліотропних та пантропних вірусів: віспи, інфекційного ларинготрахеїту птахів, катаральної лихоманки вівці та ін. Ураження може бути виконано через природну або через штучну повітряну камеру.

Для ураження через природну повітряну камеру ембріон розміщують в штативі вверх повітряною камерою і в шкаралупі проти неї вирізають віконце діаметром 15-20 мм. Через нього пінцетом знімають підшкорлупну оболонку, а на оголену ділянку хоріоналантоїсної оболонки (ХАО) наносять 0,2мл вірусовмісної суспензії, отвір закривають лейкопластирем або покривним склом, закріплюючи його парафіном.

Ураження через штучну повітряну камеру застосовують частіше, ніж через природну, тому що таке ураження забезпечує контакт вірусовмісного матеріалу з більшою поверхнею ХАО і як наслідок веде до утворення більшої кількості вірусу. Для ураження ембріону цим методом його поміщають у штатив горизонтально зародком вверх. У шкаралупі роблять два отвори: один невеликий над центром повітряної камери (необхідний для відсмоктування повітря), а інший діаметром 0,2-0,5см збоку, зі сторони зародку. Складність методу полягає в тому, що роблячи другий отвір, необхідно спочатку зняти шматочок шкаралупи, потім, не ушкоджуючи ХАО, зсунути підшкаралупну оболонку в сторону так, щоб через утворений отвір могло пройти повітря. Після цього гумовою грушею через перший отвір відсмоктують повітря з природної повітряної камери. У результаті через боковий отвір повітря заходить в середину, утворюючи штучну повітряну камеру, дном якої є ХАО.

Через боковий отвір на поверхню ХАО наносять інфекційну рідину і отвір закривають лейкопластирем. Перший отвір немає необхідності закривати, так як внутрішній листок

								Таблиця 2.9.
			Використання курячих ембріонів різного віку для
						культивування вірусів
			Ембріони		Застосування цього способу
	Вірус						ураження для
		, дні	Місце	Інкубація	діл ен	пас са жів	нн я	Отримання	кці
			ін’єкц					АГ

ї не

88

			ії						Діагностик и	Отримання вакцин
				Год.	°С
	Віруси	9-	ЖМ,	До	35-
	енцефалі			смер		+	+	+		+
	тів*	12	ХАМ	ті	37
	Вірус
	простого	12	ХАМ	72	41	+	+	+	+		+
	герпесу
	Вірус		А,
		10	АМН,	48	36	-	+	+	+	+	+
	грипу А
			ЖМ
	Вірус		А,	72-
		10	АМН,		35	+	+	+	+	+	+
	грипу В		ЖМ	96
	Вірус		АМН,
		7	А,	144	35	+	+	+	+		+
	паротиту
			ЖМ
	Вірус	6-7	ЖМ	240	36	-	+	+	+	-	+
	сказу
	Вірус			120-
	парагрип	8	АМН		35	+	+	+	+	+	+
	у 1			168
	Вірус	8-	АМН,	120-
	парагрип				35	+	-	-	-	-	-
		10	А	186
	у 2
	Вірус
	вісповак	12	ХАМ	72	37	+	+	+	+		+
	цини

•* тільки західний, східний, венесуельський та Західного Нілу;

•А - алантоїс, АМН – амніон, ЖМ – жовтковий мішок, ХАМ – хоріоналантоїсна мембрана.

підшкаралупової оболонки при цьому методі ураження не порушується і продовжує виконувати роль бар’єру для мікрофлори оточуючого середовища.

89

Подальша інкубація ембріонів, уражених цим методом, проводиться в горизонтальному положенні боковим отвором вверх.

Ураження в жовточний мішок. Цим методом користуються найчастіше при роботі з вірусами хвороби Марека, ринопневмонії коней, катаральної лихоманки вівці. Уражають ембріони 5-7- денного, а інколи і 2-3 денного віку (вірус лихоманки долини Риф). Використовують два варіанти ураження.

Перший варіант. Ембріони поміщають у штатив вверх повітряною камерою, в шкаралупі над нею роблять розріз і вводять голку на глибину 3,5 – 4 см під кутом 450С до вертикальної осі в напрямку, протилежному місцю знаходження зародку.

Другий варіант. Ураження здійснюють на горизонтально закріпленому ембріоні, при цьому зародок знаходиться внизу, а жовток над ним. Отвір у шкаралупі закривають краплею розплавленого парафіну.

Ураження в амніотичну порожнину. Для цього методу ураження використовують ембріони 6-10 денного віку. Метод використовується при культивуванні вірусів грипу, н”юкаслської хвороби, ринопневмонії коней та ін. Є два способи ураження.

Закритий спосіб. Яйце поміщають на овоскоп в горизонтальному положенні зародком вверх. Через отвір в шкаралупі над повітряною камерою вводять голку з тупим кінцем в напрямку до зародку. Доказом того, що голка проникла в амніон, є рух тіла зародка в напрямку руху голки.

Відкритий спосіб. Шкаралупу над повітряною камерою зрізають так, щоб утворився отвір діаметром 1,5-2,5 см. Через нього пінцетом знімають підшкорлупну оболонку. Потім анатомічним пінцетом захоплюють ХАО і підтягують до отвору. Притримуючи лівою рукою пінцет з фіксованою в ньому оболонкою амніону, вводять вірусовмісний матеріал. Потім оболонки відпускають, отвір закривають лейкопластирем і ембріон інкубують у вертикальному положенні.

Описані методи найбільш часто використовують в лабораторній практиці. Ураження в тіло зародку та сосуди ХАО застосовують рідко.

Ураження в тіло зародка. Для ураження використовують ембріони 7-12 денного віку. Відомо два варіанти.

Перший варіант. Уражують так, як і в амніон закритим способом, з тією різницею, що беруть гостру голку і на овоскопі показником

90