Вірусологія

а

б

в

г

Рис. 6.7. Схематичне зображення різних модифікацій ІФА: а – прямий ІФА; б – непрямий ІФА;

в – ІФА в модифікації DAS;

г – ІФА в модифікації TAS .

При прямому варіанті ІФА лунки мікроплат покривають тестуючим антигеном, інкубують, потім надлишок антигену видаляють і додають вірусспецифічне антитіло, кон’юговане з ферментом. Після інкубації надлишок кон’югату видаляють і додають субстрат (хромоген). Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену. Метод потребує мінімальної кількості операцій, незначної витрати реагентів і легко може бути

191

автоматизований.

При непрямому варіанті ферментну мітку вводять не в антивірусні імуноглобуліни, а в антитіла до них. Імунний комплекс Аг-Ат, імобілізований на твердому носії інкубують з антивидовими антитілами, які мають ферментну мітку Ат2-Ф. Головна перевага методу – простота підготовки реагентів. Виключається складна процедура підготовки сироватки – очистка, виділення IgG і зв’язування їх з ферментом; можливе використання неочищенного вірусного препарату.

При використанні сендвіч-методу або його модифікації на тверду підкладку послідовно сорбують первинні антитіла, досліджуваний антиген і вторинні антитіла. У випадку простого варіанту сендвіч-методу ферментна мітка вводиться до складу вторинних антитіл, а при модифікованому методі – вторинні антитіла проявляються комплементарними до них антивидовими ензим-міченими (ЕМ) імуноглобулінами (кон’югатом). Сендвічметод з використанням поліклональних антитіл проводять в три стадії інкубації і декілька стадій відмивки. Однак, при використанні моноклональних антитіл, специфічних до різноманітних ділянок антигену, число стадій інкубації та промивання можна скоротити. Останнім часом ця модифікація знаходить все більш широке використання, так як для постановки реакції немає необхідності отримувати специфічні для кожного конкрентного випадку ЕМ антитіла.

Серед методів ІФА можна виділити два типи – це так званий послідовний, або неконкурентний, та конкурентний аналіз.

При конкурентному гетерогенному аналізі присутні в реакційному середовищі зв’язані і не зв’язані з ферментом антигени одночасно вступають в конкурентну взаємодію з імобілізованими на твердому носії антитілами. При інкубації надлишок незв’язанних компонентів відмивають і в систему додають відповідний субстрат.

ІФА дуже зручний, оскільки антигеном у фітовірусології в імуносорбентному тесті може бути свіжий сік рослин, очищені вірусні препарати, гомогенат із насіння або з комах-переносників.

Одна з важливих переваг ІФА – висока чутливість, яка досягається, як правило, за рахунок ферментного кон’югату, збільшення періоду інкубації, особливо на стадії ферментативної реакції, і здійснення такої послідовності етапів, при якій антиген

192

зв’язується з імобілізованими на носії антитілами, а потім взаємодіє з доданими на останній стадії кон’югованими антитілами. Слід відмітити, що збільшення часу інкубації далеко не завжди приводить до підвищення чутливості реакції. В кожному випадку необхідно перевіряти, чи відбувається при більш довготривалій інкубації подальший розвиток забарвлення або її послаблення, особливо у випадку проведення реакції при підвищенній температурі.

Чутливість імуноаналізу залежить від констант зв’язування специфічних антитіл; чим більша константа зв’язування, тим чутливіша система. За чутливість методу ІФА приймається та концентрація антигену (або розведення екстракту рослин, що аналізується), при якому величина оптичної густини продукту ферментативної реакції на 0,2 оптичні одиниці перевищує величину оптичної густини в контрольних лунках.

Постановка сендвіч-методу ІФА:

1.Наносять специфічні IgG по 100 мкл в кожну лунку, інкубують 14-18 год при 4º, 3- або 5-кратно промивають буфером з твін-20.

2.В лунки, що містять імобілізовані антитіла, додають по 100 мкл досліджуваного вірусу, розведеного в буфері з БСА (бичачий сироватковий альбумін), витримують 30-60 хв при 37º або ніч при 4º, відмивають лунки, як і в першому випадку.

3.Вносять кон’югат по 100 мкл, інкубують 60 хв при 37º, відмивають.

4.Додають субстратну суміш по 100 мкл, витримують 30-90 хв при кімнатній температурі.

5.Зупиняють реакцію за рахунок внесення відповідного STOPреагенту.

6.Вимірюють результати спектрофотометрично при відповідній довжині хвилі.

При аналізі вірусу, що міститься в соці хворих рослин, контролем слугує сік листків здорових рослин. Також в якості контролю враховується неспецифічне зв’язування кон’югату в лунках, в яких антиген замінений на буфер-БСА.

На жаль, сендвіч-метод не дозволяє дати точну кількісну оцінку антигенної спорідненості вірусів однієї групи. Для вирішення цієї задачі використовують модифікацію

193

імуноферментного конкурентного аналізу. Метод заснований на конкуренції між сорбованим на твердій фазі антигеном і конкурентним (спорідненим) антигеном за центри зв’язування антитіл, гомологічних сорбованому антитілу.

Постановка конкурентного варіанту ІФА:

1.В лунки вносять по 200 мкл антигену в буфері, що використовують для сорбції, інкубують суміш 18год при 4º, реагенти, які не зв’язались, тричі відмивають.

2.Послідовно вносять по 50 мкл розчину досліджуваного антигену (спорідненого або конкурентного) і 150 мкл сироватки в буфері-БСА, гомологічної сорбованому на планшеті антигену. Після інкубації при 37º 4-5 год вміст лунок промивають.

3.В лунки вносять по 200 мкл розчину антивидового кон’югату (наприклад, IgG віслюка проти IgG кролика, мічені ферментом). Вміст лунок інкубують 1-1,5 год при 37º і промивають.

4.Наносять субстрат і вимірюють ферментативну активність як в сендвіч-методі.

Аналіз проводиться в рівноважному режимі і час його проведення лімітований в основному часом досягнення рівноваги реакції антиген-антитіло. Для досягнення порогової чутливості використовують мінімальну кількість сорбованого антигену і концентрацію антитіл, що забезпечують зв’язування 50% сорбованого антигену при відсутності конкуренту.

Практична частина

Практична робота №1

Завдання: визначити титр вірусу в реакції гемаглютинації. Матеріальне забезпечення: вірусовмісний матеріал, 1,0-1,5%

завись еритроцитів, фізіологічний розчин, планшети з округлими лунками, піпетки, гумові груші, дезрозчин, маркер.

Хід роботи

1.Приготувати 2% завись еритроцитів на фізіологічному розчині.

2.Приготувати в планшеті двократні розведення матеріалу, що містить вірус, на фізіологічному розчині. Для цього до ряду лунок розлити, наприклад, по 0,02 мл фізіологічного розчину. В першу

194

лунку додати 0,02 мл досліджуваного матеріалу (отримали розведення 1:2), перенести з неї 0,02 мл до другої, з неї стільки ж до наступної і т.д. З останньої лунки 0,02 мл матеріалу відібрати в дезінфікуючий розчин.

3.Для контролю до 4-5 лунок поруч з дослідним рядом налити по 0,02 мл фізіологічного розчину.

4.До кожного розведення вірусу і до контролю додати рівний об’єм еритроцитів.

5.Струснути планшет і залишити при 370С приблизно на півгодини.

6.Врахувати результати реакції.

Контрольні завдання: Занотувати в робочі журнали:

-Схему постановки реакції гемаглютинації.

-Визначення титру вірусу за результатами проведеної реакції.

-Сформулювати висновки по отриманим результатам. Замалювати в альбоми:

-Результати постановки реакції гемаглютинації.

Контрольні запитання:

1.Який механізм РГА?

2.Назвіть фактори, що впливають на ефективність РГА.

3.Що таке титр вірусу в РГА?

4.В чому принцип визначення титру вірусу в ГАО? Завдання для самостійної роботи:

1.Чим РГА відрізняється від інших методів титрування вірусів?

2.Як можна за допомогою РГА очистити та зконцентрувати вірус грипу?

3.Які переваги і недоліки різних методів титрування вірусів?

Практична робота №2

Завдання: визначити титр вірусу і сироватки в реакції кільцепреципітації.

Матеріальне забезпечення: вірусовмісний матеріал, сироватка, фізіологічний розчин, пробірки, піпетки, гумові груші, дезрозчин, маркер.

Хід роботи

195

1.Приготувати двократні розведення матеріалу (антигену або антитіла) на фізіологічному розчині. Для цього в 8 пробірок розлити, наприклад, по 2 мл фізіологічного розчину. В першу пробірку додати 2 мл матеріалу (отримали розведення 1:2), перенести з неї 2 мл до другої, з неї стільки ж до наступної і таким чином до 7 пробірки, з якої 2 мл матеріалу відібрати в дезінфікуючий розчин. 8-му пробірку залишити з фізіологічним розчином для контролю.

2.До кожної пробірки, крім 7-ї (контроль на інший компонент) обережно нашарувати рівний об’єм іншого матеріалу, титр якого ми визначаємо.

3.В 7-му пробірку нашарувати фізрозчин та врахувати результати.

Контрольні завдання: Занотувати в робочі журнали:

-Схему постановки реакції кільцепреципітації.

-Визначення титру вірусу або сироватки за результатами проведеної реакції.

-Записати результати титрування та написати висновки. Замалювати в альбоми:

-Результати постановки реакції кільцепреципітації.

Контрольні запитання:

1.В чому принцип реакції кільцепреципітації?

2.Які задачі дозволяє вирішувати ця реакція?

3.Які контролі і для чого супроводжують реакцію?

4.За якими ознаками визначають титр в реакціях преципітації?

Завдання для самостійної роботи:

1.Які преципітаційні тести Вам відомі?

2.В чому переваги та недоліки імунодифузійних тестів?

3.Характеристика методу dot-ELISA та його використання.

4.Що таке антивидові антитіла і з якою метою вони використовуються в ІФА?

5.Чи можливе кількісне визначення антигену за допомогою імуноферментного аналізу?

6.Застосування різних ферментних міток в ІФА.

Список літератури

6.Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ. /Под ред. Д. Кэтти. – М.:

Мир, 1991. – 287 с.

196

7.Антитела. Методы: Кн. 2: Пер. с англ. /Под ред. Д. Кэтти. – М.:

Мир, 1991. – 384 с.

8.Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. - М.:

Мир, 1978. – 429 с.

9.Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. – М: Наука, 1985. – 183с.

10.Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. –

М: Наука, 1993. – 301 с.

11.Гнутова Р.В. Вирусология с основами иммунохимии. – Владивосток: Дальнаука, 1999. – 163с.

12.Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. /Под ред. Т.В. Перадзе, П. Халомена. – М. – 1985.

13.Иммуноферментный анализ. /Под ред. Т.Нго, Г. Ленхоффа.

М.: Мир, 1988.

14.Меклер Л.Б. Методы вирусологии и молекулярной биологии. - М.: Мир, 1972. – 444 с.

15.Метьюз Р. Вирусы растений. – М.: Мир, 1973. – 600 с.

16.Практикум із загальної вірусології. /За ред. А.Л. Бойка. – К.: Видавничий центр «Київський університет», 2000. – 269 с.

17.Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. – М.: Мир, 2000. – 582 с.

18.Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. – М.: Колос, 2000. – 272 с.

19.Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak. Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA. – 1998. - ASM Press, Washington. – 683 p.

20.-Flint S. J., Enquist L.W., Krug R.M., Racaniello V.R., Skalka A.M. Principles of Virology: Molecular biology, Pathogenesis, and Control. – 2000. – ASM Press, Washington. – 804 p.

21.Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H. Plant Virus Disease Control.- 1998. - ASM Press, Minnesota. – 683 p.

197

Тема 2. Застосування полімеразної ланцюгової реакції у вірусологчних дослідженнях

Зміст

Вступ Обладнання для ПЛР Компоненти реакції

Параметри температурних циклів Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК

Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях Контрольні запитання Література

Вступ

Одним з важливих завдань, що стоять перед сучасною вірусологічною наукою, є своєчасне виявлення та ідентифікація вірусів – збудників інфекційних захворювань. В останній час все більше розповсюдження одержують найновіші методи діагностики, які базуються на виявленні в досліджуваних клінічних та рослинних зразках специфічних послідовностей вірусного геному. Найбільшого розповсюдження набула полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (PCRpolymerase chain reaction).

Більш ніж за 20 років, які пройшли з часу відкриття ПЛР (1983 рік, Кері Мюлліс, Cetus, California) ПЛР знайшла застосування в усіх галузях біології, опубліковано тисячі робіт, в яких використовувалася ця реакція.

ПЛР значно полегшила роботу молекулярних біологів, вірусологів – з її допомогою можливе отримання якої завгодно кількості фрагментів специфічної ДНК.

Зараз жодне молекулярно-біологічне дослідження генів, в тому числі і вірусних, не обходиться без іі застосування. ПЛР використовується не тільки для детекції аномальних генів та вірусів, але і для фундаментальних досліджень в області молекулярної біології. Завдяки ПЛР стало можливим досліджувати віруси, вбудовані в геном клітини-господаря, а також віроіди та вірусоіди. ПЛР дає можливість протягом дня з одієї молекули ДНК отримати 100 млрд. подібних по структурі молекул. Ця реакція дуже проста у виконанні, необхідні лише пробірка, декілька

198

відносно простих реагентів, джерело тепла та охолодження. Препарат ДНК, якій необхідно копіювати, може бути очищеним, а може представляти собою складну суміш біологічних речовин. Як джерело ДНК підходить і біоптат з тканини пацієнта, і тотальна НК з рослин, і одна волосина, і крапля крові, знайдена на місці злочину, і мозок мумії і навіть тіло мамонта, який пролежав 40 000 років у вічній мерзлоті.

Застосування молекулярних методів для діагностики ДНК обмежується їх невисокою чутливістю та часом, який необхідний для аналізу. Так, для визначення нукелїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ з застосуванням радіактивно міченого зонду необхідно, щоб мішень була присутня в препараті в кількості декількох тисяч копій. Нерідко число аномальних (або вірусних) послідовностей в клінічному препараті діагностично значиме, але менше цієї величини, тоді гібридизація може дати псевдонегативний результат. На відміну від цього ПЛР виявляє унікальну нуклеотидну послідовність навіть в одній копії ДНК. На табл.6.1 приведені дані, які дозволяють порівняти метод ПЛР з іншими молекулярно-біологічними методами досліджень.

Таблиця 6.1. Прівняння ПЛР з іншими молекулярно-біологічними методами.

	ПЛР	Блот-	Гібридизаці
		гібридизація	я in situ
		за Саузерном
Чутливість	1/100 000*	1/100	10 мішеней
			на клітину
Специфічність	Висока	Висока	Висока
Термін	< 1 доби	1 тиждень	1 доба
аналізу
Можливість	ні	ні	так
клітинної
локалізації

*1 копія на 100 000 клітин

Труднощі, з якими стикаються дослідники при дослідженні ДНК, обумовлені самою її природою.

З курсу загальної біохімії та біохімії вірусів відомо, що ДНК - це "тендітні" ланцюги, які побудовані з 4-х типів

199

дезоксирибонуклеотидів: дезоксіаденінтрифосфата (А-аденін), дезоксітимидінтрифосфата (Т-тимин), дезоксігуанінтрифосфата (Г- гуанін), дезоксіцитиднтрифосфата (Ц-цитозин). В послідовності цих основ закодована генетична інформація – триплет нуклеотидів кодує одну амінокислоту. Одиночні ланцюги ДНК зустрічаються рідко, звичайно пари ланцюгів з комплементарними послідовностями утворюють подвійні спиралі, в яких залишки А зв’язані з залишками Т, а залишки Г з залишками Ц (Рис.6.8). Кожний ланцюг складається з цукро-фосфатного остова, вздовж якого перпендикулярно довгій осі подвійної спиралі розташовані основи, які зв’язані водневими зв’язками. Кінці ДНК хімічно відрізняються, один підписують як 5’ (залишок фосфорної кислоти), другий 3’ (цукор). В подвійній спіралі ДНК комплементарні ланцюги антипаралельні, як наслідок, 3’ кінець одного ланцюга зв’язаний з 5’ кінцем іншого.

Рис.6.8. Схематичне зображення молекули ДНК

Вклітинах молекули ДНК оточені білками, які забезпечують її більш щільне скручування. Як правило, не вдається виділити ДНК непошкодженою – нитка частіше всього розірвана в випадкових місцях, а це дуже обтяжує подальші дослідження.

Внормальних умовах ДНК являє собою складно побудовану молекулу з 4-мірною структурою. В клітині реплікація вібдувається завдяки ферменту ДНК-полімеразі (рис. 6.9). Вивчені молекули ДНК-полімераз, які виділені з різних вірусів. Вони

200