Вірусологія

аерація, кількість бактерій повинні бути однакові. Змінною є тільки кількість внесеного фагу.

Практична робота: Титрування фагу методом агарових шарів

Досить точним методом оцінки активності бактеріофагу є визначення кількості інфекційно-активних одиниць бактеріофагу в одиниці об’єму (титр бактеріофагу). Для цієї мети, як правило, користуються методом агарових шарів, запропонаваним Граціа (1936 р.). Суть методу полягає у тому, що культуру індикаторних бактерій в “м’якому” (0.7%) агарі при 46ОС заражають фагом у відповідному розведенні. Цю суміш виливають на поверхню захоловшого 1.4% поживного агару, дають захолонути верхньому шару агару і ставлять на інкубацію в термостат. На протязі 6-12 годин бактерії розмножуються всередині м’якого шару агару. Низька концентрація верхнього шару сприяє дифузії фагових частинок. В результаті фагові частинки заражають бактеріальні клітини, які знаходяться по сусідству з ними, розмножуються та лізують їх. Фагове потомство інфікує надалі сусідні бактерії, які, в свою чергу, піддаються лізису в результаті появи другого покоління фагу, і так далі. В результаті на бактеріальному газоні утворюються прозорі зони відсутності росту бактерій - негативні колонії або бляшки. Утворення кожної бляшки викликається однією частинкою бактеріофагу. Отже, число негативних колоній може слугувати кількісним показником вмісту інфекційних фагових частинок в досліджуваному розчині.

Поживний агар розплавлений (45)

+бактерія

+фаг

Поживний

агар

затверділий

Рис.3.9. Техніка виконання досліду за методом агарових шарів.

141

Завдання: опанувати методику титрування бактеріофагів методом подвійних агарових шарів, визначити титр бактеріофагу Т4.

Матеріальне забезпечення: Пробірки з ватно-марлевими пробками, чашки Петрі, штатив, груші та піпетки (самплери та носики), маркери, поживне середовище (LB), агаризоване середовище (0,7% та 1,4%) нічна бактеріальна культура, бактеріофаг, термостат, водяна баня.

Хід роботи:

1.1,4% агар заливають в чашки Петрі по 2,5-3,0 мл, підсушують (Рис. 3.9).

2.Досліджуваний фаг титрують методом 10-кратних розведень (як і в методі Аппельмана). Контроль (пробірка №8) ставлять на ріст бактеріальної культури, №9 - на стерильність фагу та середовища.

3.В пробірку наливають 2,5 мл розплавленого 0,7%-ного агару та охолоджують до 450С, потім додають 1мл бактеріофагу в певному розведенні і 0,2 мл бактеріальної культури. Вміст пробірки ретельно перемішують та виливають в чашки Петрі на нижній агар. Нумерація чашок Петрі з нижнім і пробірок з верхнім агаром відповідає нумерації розведень фага. Ті ж самі висіви проводять із контрольних пробірок, які позначають як контролі на ріст бактерій (№8) та стерильність фагу (№9).

4.Після того, як верхній шар захолов, чашки Петрі ставлять на інкубацію (в термостат на 18-20 годин при 37оС). Для статистичної достовірності кожен дослід проводять в трьох повторностях.

Облік результатів титрування показує, що при великій концентрації фагу (перші 4 чашки) спостерігається суцільний лізис культур - чашки прозорі. В тих розведеннях фагу, де спостерігається зменшення кількості фагу, з‘являються окремі ізольовані негативні колонії, які можна підрахувати. Кількість негативних колоній знаходиться в оберненій залежності від

142

розведення фагу. Щоб вирахувати кількість фагових часток в 1 мл фаголізату, користуються формулою:

n = y × x ,

де: n - кількість фагових часток; y - кількість негативних колоній фага на ч. Петрі; x - розведення фагу.

Наприклад, якщо в ч. Петрі №7 (розведення фагу 107) утворилося 15 негативних колоній, то титр даного фагу буде дорівнювати кількості негативних колоній, помноженій на розведення фагу, тобто 15 107 або 1,5 108 ф/мл.

Методичні рекомендації:

Найголовнійша вимога при роботі з бактеріями – це стерильність роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією.

При розведенні бактеріофагу необхідно кожного разу брати нову піпетку (носик для самплера). Після додавання фагу в верхній агар слід ретельно перемішати вміст пробірки та обережно вилити на поверхню нижнього застигшого та підсушеного агару. Після того, як верхній агар застигає, чашки Петрі ставлять у термостат. Оскільки на кришках чашок збирається конденсат, який при зкапуванні на бактеріальний газон може зпотворювати результати титрування, то чашки Петрі ставлять кришками до низу. При титруванні фагу об’єм і склад середовища, температура, кількість бактерій повинні бути однакові. Змінною є тільки кількість внесеного фагу.

Більш точні результати титрування фагу цим методом отримують тоді, коли визначають кількість частинок фагу в вихідній рідині по декількох розведеннях і визначають їх середнє арифметичне.

Слід зазначити, що підраховувати негативні колонії краще на чашках Петрі, де виросло не менше 5, але не більше 50 негативних колоній, тому що більша та менша кількість негативних колоній дасть неточні результати. Якщо ж на чашках Петрі утворилась велика кількість негативних колоній, то її розділяють на 2, 4, 6 і більше секторів, а потім отриману цифру множать на кількість секторів.

143

Практична робота: Виділення фагів із лізогенних культур

В деяких випадках для виділення фага із лізогенних культур доводиться застосовувати методи індукції профагу (ультрафіолетовим опроміненням або температурою).

Завдання: відпрацювати методику виділення бактеріофагу λ з лізогенної культири E. coli.

Матеріальне забезпечення: груші та піпетки, чашки Петрі, бактеріальні петлі, маркери, агаризоване середовище (1,4%), бактеріальні культури (E. coli BE та E.coli K12), ультрафіолетова лампа, термостат.

Хід роботи:

1.Заливають в чашки Петрі 1,4% поживний агар по 2,5-3,0 мл, підсушують. Ділять чашку на 4 сектори та підписують.

2.Стерильною петлею набирають бактеріальні культури (E.сoli

К12 та E.сoli BE) зі “скошеного” агару та розсівають методом “штриха” на поверхню поживногог агару в два сектори (рис.3.10.). Обробляють чашки з висіяною культурою ультрафіолетовим випроміненням протягом 10 хвилин.

3.Ті ж культури висівають в третій та четвертий сектори та

підписують як контроль К12 та контроль ВЕ. Ставлять на інкубацію (12 год. при 370С).

144

Рис. 3.10. Розсів бактеріальної культури методом штрихів.

При вірних контролях (в третьому та четвертому секторі спостерігається ріст бактеріальних колоній) проводять облік результатів. В результаті опромінення помірною дозою ультрафіолету бактерії, що несуть профаг, лізуються та вивільняють в оточуюче середовище велику кількість фагових частинок. В тому секторі, на який висівалась лізогенна культура, будуть відсутні колонії бактеріальних клітин. Нелізогенна культура буде формувати нормальні колонії.

Методичні рекомендації:

Найголовнійша вимога при роботі з бактеріями – це стерильность роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією. Перед нанесенням бактерії на поверхню агару, слід ретельно прожирити мікробіологічну петлю.

Оскільки на кришках чашок збирається конденсат, який при зкапуванні на бактеріальний газон може зпотворювати результати титрування, то чашки Петрі ставлять кришками до низу.

К о н т р о л ь н і п и т а н н я

1.Які властивості фагів лежать в основі їх отримання та використання?

2.Чому титрувати фаги потрібно в стерильних умовах?

3.З яких пробірок починають враховувати результати титрування фагу за методом Аппельмана? Чому не більше 24 годин для обліку реакції?

4.Чому метод Граціа більш вживаний, ніж інші методи?

5.Яким чином розмір негативної колонії залежить від розміру фага?

145

6.Які переваги мають бактеріальні віруси над іншими в аспекті використання їх як модельних об’єктів?

7.Що таке негативна колонія і яким чином вона утворюється?

8.Розвиток подій при лізогенізації фагом λ бактеральної культури.

9.Яка роль білка-репресора бактеріофагу λ в підтриманні лізогенного стану бактеріальної клітини?

10.Що таке індукція?

11.Яким чином в лізогенній культурі можна виявити профаг?

12.Чи можна інфікувати лізогенну культуру цим же бактеріофагом?

13.В чому відмінність між вірулентними та помірними фагами?

Ко н т р о л ь н і з а в д а н н я

1.Визначити титр фагу, коли на ч. Петрі №6 утворилося 16 негативних колоній.

2.Який буде титр фагу, коли на ч. Петрі №7 спостерігається суцільний лізис і в контролі бактерії також відсутній ріст тест-культури?

3.Пояснити чому з часом негативна колонія перестає збільшуватись у розмірі.

4.Порівняти методи титрування бактеріофагів за Апельманом та за Граціа.

5.Скласти схему виділення бактеріофагів, які уражують фітопатогенні бактерії.

Література

1.Луриа С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кемпбелл.Общая вирусология: Пер. с англ. Э. - М.: Мир., 1981.- 680с. с ил.

2.Мекшенков М.И., Серегина Т.М. Генетический контроль развития бактериофага Т4. М.: “Наука”, 1977. 198с.

3.Михайлов А.М., Кафтанова А.С., Корнев А.Н. О строении бактериальных вирусов.- Пущино, 1987.- 152с., ил.

146

4.Практикум по общей вирусологии. Под ред. И.Г.Атабекова.- М.: Издательство Московского университета. 1981. 192с.

5.Тихоненко А.С. Ультрасруктура вирусов бактерий.- М., «Наука», 1968, 170 с., ил.

6.Mudy M.F. Sheath of bacteriofege T4 // J. Mol. Biol.- 1873.-v. 80. – р. 613-636.

7.Simon L.D., Anderson T.F. The infection of Esherichia coli by T2 and T4 bacteriophages as seen in the electron microscope // I, II, Virology.– 1967.- v. 32. – р.279-305.

8.Crowther R.A,. Lennk E.V., Kikushi Y. Ultrastructure of baseplate of T-even bacteriophage// J. mol. Biol.-1977.- v. 166.- p.489-523.

147

РОЗДІЛ 4. ДОСЛІДЖЕННЯ ВІРУСІВ РОСЛИН

Тема. 1 Способи передачі вірусів рослин. Рослини-індикатори. Зміст

Теоретична частина Способи передачі вірусів рослин. Рослини-індикатори Практична частина Лабораторне заняття Мета заняття Матеріальне забезпечення Хід роботи Контрольні завдання Контрольні запитання

Тема. Способи передачі вірусів рослин. Рослини-індикатори.

Зовнішня поверхня рослин має захисні шари кутикули та пектину, крім того кожна клітина рослини оточена клітинною оболонкою. На сьогодні не відомо, щоб віруси рослин використовували специфічні клітинні рецептори, як це роблять віруси тварин та бактерій. Віруси рослин використовують порушення механічної цілісності клітинної оболонки, це досягається шляхом передачі вірусу механічно, або за допомогою вектору. Передача вірусів рослин здійснюється за допомогою насіння, вегетативно, переносниками (грибами, нематодами, членистоногими).

Фітовіруси викликають у рослин різні патологічні зміни, тому що вірусна інфекція може зачіпати практично всі сторони життя рослини. Найбільш часто спостерігається зміна забарвлення (пожовтіння, хлороз), відмирання тканин (некроз) або деформація вегетативних органів рослин.

Розрізняють чотири основні типи реакцій рослин на ураження їх вірусом:

-імунність- коли рослини не уражуються вірусом (синонім

– стійкість)

148

-надчутливість – коли рослини уражуються з утворенням місцевих некрозів, які з”являються внослідок відмирання клітин біля точки зараження

-толерантність – коли вірус транспортується по тканинам рослини, але симптоми захворювання слабо виражені або не виражені зовсім (замасковані)

-системне ураження – коли вірус транспортується по всіх тканинах рослини і репродукується в них з чітким проявом симптомів захворювання

Вірусне ураження рослини може проявлятися як системно, так і носити локальний характер (рис.17-20 (кольорова вклейка)).

Локальні ураження проявляються на листку поряд з місцем ураження, це – хлоротичні місцеві ураження, ураження некротичного типу та кільцева плямистість. Симптоми системного ураження поширюються по рослині; серед них затримка росту (карликовість), наприклад викликана вірусом жовтої карликовості ячменю. Крім карликовості рослини, що інфіковані вірусом, можуть мати і інші типи аномального росту, такі як енації, деформації листової пластинки, пухлинні нарости у вигляді бородавок. У порівнянні з листковими пластинками корені і стебла рідше підлягають змінам під впливом вірусної інфекції, проте при зараженні вірусом коротковузля винограду часто спостерігаються фасціації стебел, а вірус деформації пагонів какао викликає здуття на стеблах і коренях цих рослин.

Одним з найбільш розповсюджених симптомів на листках є поява світло- і темно-зелених ділянок, що утворюють мозаїчний

візерунок. Границі між темними				і світлими ділянками можуть
бути	або	чіткими, або розпливчатими. У залежності від
розміщення		мозаїчних	плям	розрізняють	прижилкову,
міжжилкову,		жовту мозаїки.

При деяких вірусних захворюваннях (жовтуха цукрового буряку, ксантоз суниці) характерним є хлоротичне забарвлення листкової пластинки, що зумовлено змінами у хлоропластах. У темно-зелених ділянках листка хлоропласти розміщуються рівномірно, в більш світлих ділянках агрегують, а в самих світлих зливаються і руйнуються. Для деяких груп вірусів показано, що в темно-зелених ділянках міститься значно менше вірусу, ніж у світло-зелених.

Віруси відрізняються по здатності інфікувати різні рослини: кількість сприятливих рослин варіює у різних вірусів. Коло

149

господарів вірусу і симптоми, які вони викликають, є характерними ознаками для даного вірусу і використовуються поруч із іншими для ідентифікації вірусу. Вірусна інфекція проявляється на зовнішньому вигляді рослини, хоча це є відображенням внутрішньоклітинних змін, викликаних вірусом. Симптоми ураження можуть бути різними і залежать від рослинигосподаря, тривалості інфекції, штаму вірусу та умов зовнішнього середовища. Наприклад, симптоми захворювання найбільш чітко виражені у рослин, які вирощені при яскравому світлі при помірній температурі. Для ідентифікації вірусів за візуальним симптомами використовують так звані рослини-індикатори.

Рослини-індикатори – це рослини, які дають чітку специфічну реакцію на даний вірус, що легко відрізняється від реакції цієї рослини на інший вірус.

Як індикатори в фітовірусології найчастіше використовують рослини таких родин (таб. 4.1.).

Пасльонові (Solanacea) – Nicotiana tabacum, N. clevelandii, N.glutinosa, N. debneyi, Petunia hybrida, Lycopersicon esculentum, Datura stramonium, Physalis floredana.

Лободові (Chenopodiaceae) – Chenopodium amaranticolor, Ch. quinoa.

Бобові (Fabaceae) - Phaseolus vulgaris, Vicia faba, Vigna sinensis, Melilotus officinalis.

Злакові (Poaceae) - Zea mays.

Гарбузові (Cucurbiaceae) – Cucurbita maxima, Cucumis sativus. Щирицеві (Amaranthaceae) – Gomphrena qlobosa.

За допомогою рослин-індикаторів можна вирішити такі завдання:

−визначити інфекційну природу збудника;

−визначити коло рослин-господарів;

−відокремити вірус із суміші при змішаних вірусних інфекціях;

−визначити концентрацію вірусів у рослинах;

−накопичити вірус з метою подальших фізико-хімічних досліджень;

−встановити видову приналежність патогену.

Таблиця 4.1. Реакція рослин-індикаторів на віруси

Вірус	Рослини-індикатори	Реакція рослин
Вірус	Тютюн клейкий –	Локальна реакція,
тютюнової	Nicotiana glutinosa L.	некрози
	150