Lektsii_po_fiziki

За счет указанных белков полностью или частично осуществляются специфические функции мембран: проницаемость, активный транспорт через мембрану, генерация электрической разности потенциалов и др.

Мембраны не являются неподвижными структурами. Липиды и белки обмениваются местами и перемещаются вдоль плоскости (латеральная диффузия) и поперек плоскости мембран (диффузия флип-флоп) .Латеральная диффузия сопровождается высокой подвижностью липидов, а диффузия флип-флоп – низкой подвижностью, т.е. обмен местами липидов, находящихся на разных сторонах мембраны, является маловероятным процессом.

Физиологические функции мембран.

1)Делят клетку на отдельные участки, фазы, в которых протекают различные биохимические реакции, которых в клетках протекает до тысячи видов.

2)Принимают участие во всех процессах обмена веществ, которые обусловливают жизнедеятельность клетки. Это происходит потому, что мембранные структуры в организмах составляют огромную поверхность (до десятков тысяч квадратных метров). Поэтому биохимические реакции протекают в основном на поверхности мембран, обеспечивая обмен веществ.

3)Координируют и регулируют биохимические и биофизические процессы в клетках. Мембраны являются своеобразным устройством, воспринимающим сигналы извне и преобразующим их в команды, регулирующие обмен веществ в клетке.

4)Клеточные мембраны обеспечивают адгезию (сцепление) клеток друг с другом, что обеспечивает существование ткани. Адгезия осуществляется специализированными структурами на клеточных мембранах (иногда это просто как механическое сцепление типа”гнездо-шип", иногда химическая связь, иногдасклеивающее цементнообразное вещество”).

2.Физические свойства мембран.

1. Измерение подвижности молекул мембраны и диффузия частиц через мембрану свидетельствуют о том, билипидный слой ведет себя подобно жидкости. Но, с другой стороны, мембрана есть упорядоченная структура, свойственная кристаллам. Эти два факта заставляют думать, что фосфолипиды в мембране находятся в жидкокристаллическом состоянии.

81

2.Вязкость липидного слоя мембраны на 2 порядка (в 100 раз) выше, чем у воды. От вязкости липидного слоя зависит скорость поступательного и вращательного движения молекул (в том числе мембранных белков и ионов), т.е. вязкость определяет подвижность ионов и молекул, проникающих через мембрану (проницаемость мембраны), а, следовательно, регулирует скорость протекающих в мембранах ферментативных реакций.

3.Поверхностное натяжение липидного слоя на 2-3 порядка (100-1000 раз) меньше, чем у воды. Значит поверхностная энео-

гия липидного слоя незначительна фузию веществ через мембрану.

æ	σ =	WП ö		, что облегчает диф-
è		S	ø
ç		÷

4.При изменении температуры в мембране наблюдаются фазовые переходы: плавление липидов при нагревании и кристаллизация при охлаждении. Структура молекул в жидком и кристаллическом состояниях различна. В жидкой фазе молекулы фосфолипидов могут образовывать полости (кинки), в которые способны внедряться молекулы диффундирующего вещества.

5.Двойной фосфолипидный слой уподобляепт мембрану конденсатору. Электроёмкость 1 мм2 мембраны составляет 5-13 нФ.

Модели искусственных мембран для изучения свойств мембран.

1.Частокол Ленгмюра – монослой фосфолипидов. Модель создана в 1917 году.

На поверхность воды наносят каплю растворенных в каком-либо растворителе фосфолипидов или жирных кислот. После распределения их молекул на поверхности воды и испарения расворителя на поверхности воды остается пленка. Ад-

сорбированные молекулы липидов располагаются перпендикулярно поверхности воды.

2. Липосомы – широко распространенная модель. Это мельчайшие пузырьки, состоящие из билипидной мембраны. Получаются при обработке смеси воды и фосфолипидов ультразвуком. На ней хорошо изучать влияние состава фосфолипидов на свой-

82

ства мембран или влияние мембран на свойства втсраеваемых белков.

3. Билипидная мембрана. Берется два водных раствора, разде-

ленных тефлоновой перегородкой с отверствием. Отверствие заполняют фосфолипидом, растворенным в гексане. Когда растворитель и изли-

шек липида растекаются по тефлону, в отверстии образуется бислой, тол-

щиной в несколько нанометров.

На такой мембране удобно изучать проницаемость мембраны для разных агентов, измерять сопротивление мембраны или генерируемый на ней потенциал.

Методы исследования мембран

1. Микрокалориметрия. Изучаются фазовые переходы на каком-либо участке мембраны и оценивают размеры “кооперативных единиц”, т.е. число молекул, участвующем в фазовом переходе. Для этого измеряют теплоемкость C суспензии фосфолипидов при разных температурах в области фазового перехода. Например, для синтетического липида дистеароил-фосфати- дил-холина графики зависимости C от T , где T - абсолютная температура выглядят так

83

до T2

C = QT

В области фазового перехода при TC происходит резкое возрастание теплоемкости. Площадь под кривыми соответствует количеству теплоты Q , поглощаемого при переходе из твердого состояния в жидкое. Зная массу m фосфолипида в пробе, можно рассчитать энтальпию плавления

H = mQ

и энтропию при плавлении

S = TH .

C

Энтрапия S возрастает с ростом длины углеводородной цепи жирных кислот, причем на каждую метиленовую группу приходится примерно постоянное увеличение энтропии при фазовом переходе. Т.о. мы можем судить о длине куглеводородной цепи липидов.

Площадь под кривой от T1

S = Tò2CdT

T1

пропорциональна количеству молекул уже претерпевших фазовый переход.

2. ИК - спектроскопия.

84

Этот метод основан на замечательном свойстве природы: молекулы каждого вещества имеют индивидуальные, специфические спектры поглощения. Молекулярные спектры позволяют исследовать состав мембран, строение молекул в мембране и характер межмолекулярных взаимодействий.

3.Люминесцентный анализ.

Производят на спектрофлюоиметрах.

Молекулы белков обладают флюоресценцией. Параметры флюоресценции чувствительны к структуре окружения флюоресцирующей молекулы. Поэтому по люминесценции можно изучать химические превращения и межмолекулярные взаимодействия.

Для исследования мембран к мембранным системам добавляют флюоресцирующие молекулы: флюоресцентные зонды, если молекула образует нековалентную связь с мембраной , или флюоресцентные метки, если молекула образует химическую связь с мембраной.

При освещении мембранной системы с флюоресцирующей молекулой поляризованным светом люминесценция оказывается также поляризованной. Если флюоресцентный зонд неподвижен (например, раствор заморожен), то степень поляризации P0 будет мексимальной. Однако, если зонд или метка находятся в жидком растворе, то он за время возбужденного состояния успевает переориентироваться (перестроится), а поэтому изменится и степень поляризации люминесценции до величины P . Изменение степени поляризации зависит от вязкости окружающих зонд молекул. Т.о люминесцентный анализ позволяет определить вязкость мембран, а также конформационные перестройки в белках

имембранах.

4.Рентгеноструктурный анализ.

В основе этого метода лежит дифракция рентгеновского излучения на структуре мембран. Т.к. липиды мембраны есть жидкий кристалл, то дифракционная картина непосредственно связана с внутренней структурой кристалла, т.е. с расположением атомов в кристалле. Т.о. рентгеноструктурный анализ позволяет определить строение и параметры липидных молекул.

5.ЭПР

6.ЯМР

85

К методу рентгеноструктурного анализа мы вернемся при изучении рентгеновского излучения, а методы ЭПР и ЯМР мы изучим в конце года.

Диффузия в жидкостях. Закон Фика

Важным элементом функционирования мембран является их способность пропускать или не пропускать атомы (молекулы) и ионы, т.е. проницаемость мембран.

Вероятность такого проникновения частиц зависит как от направления их перемещения (например, в клетку или из клетки), так и от разновидности молекул и ионов.

Эти явления изучаются в разделе физики, называемолм явлениями переноса (диффузия, теплопроводность, перенос импульса, электропроводность). Эти явления представляют собой необратимые процессы.

Мы рассмотрим только те явления, которые характерны для мембран: диффузию и перенос заряда (синоним слова перенос в биофизике - транспорт).

Диффузия – самопроизвольный процесс проникновения вещества из области большей концентрации в область меньшей концентрации в результате теплового хаотичного движения.

Качественными характеристиками диффузии являются:

1.Поток вещества

Φ= mt - масса вещества, переносимого через площадь S , перпен-

дикулярную движению частиц, в единицу времени.

2. Плотность потока вещества I = ΦS = S mt - масса вещества, пере-

носимого через единицу площади S , перпендикулярной движению частиц, за единицу времени.

Молекулы жидкости перескакивают из одного равновесного состояния в другое. В одном из равновесных состояний поместим площадку S и определим, какое число молекул пройдет через неё из двух ближайших равновесных состояний 1 и 2.

86

Отложим слева и справа от S расстояния δ (длина свободного пробега молекулы) и построим параллепипеды 1и 2, площадью S и толщиной l << δ .

Объёмы параллепипедов V1 = V2 = S × l .

Для упрощения будем считать, что молекулы движутся с одинаковыми средними скоростямиυ = δτ , где τ - время свободно-

го пробега (перескока).

Пусть число молекул в единице объёма (концентрация) в первом объёме n1, во втором n2 . Тогда общее число молекул в первом объёме n1 × S × l , во втором - n2 × S × l .

Молекулы движутся хаотично по всем трем направлениям: x, y, z . Из них 13 движется в направлении оси Ox, 13 - Oy , 13 - Oz

. Причем в направлении x , например, половина из этой 13 движется влево, половина - вправо. Поэтому вдоль оси Ox от перво-

го параллепипеда к площадке S			движется	1	n1Sl молекул, а от
				6
второго -	1	n2 Sl . Т.о. за время	t через площадку S проходит
	6
число молекул

N = 16 n1Sl − 16 n2 Sl = 16 Sl(n1 − n2 ).

Пусть масса одной молекулы m0 , тогда за время t через площадку S переносится масса вещества

87

Dm = m0 × DN = 16 m0Sl(n1 - n2 ) .

Время пролета молекулами площадки S параллепипедов 1 и 2 (через центральную оно будет таким же)

t = υl = lδ×τ .

Поток вещества через площадку определится как

F = Dmt = 16 × mD0Slt (n1 - n2 ) = 16 × m0τSδ (n1 - n2 ) .

Можно показать, что

n1 - n2 = dndx × 2δ ,

где dndx - градиент концентраций. Поток вещества тогда запишем как

F =	1	×	m Sδ	×	dn	× 2δ =	1	×	m Sδ 2	×	dn
	6		0		dx		3		0		dx
			τ						τ

Через единицу площади переносится поток вещества (плотность потока)

I = F = 1 × m0δ 2 × dn .

S 3 τ dx

Введем массовую концентрацию c = m0n . Тогда

m0 dndx = dmdx0n = dcdx - градиент массовой концентрации.

Обозначим	1	δ 2	и назовем её коэффициентом диффузии,
	3	τ = D

а также учтем, что суммарная плотность потока направлена в сторону уменьшения концентрации, и укажем это напрвавлние знаком “-“. Получим уравнение Фика:

I = -D dcdx .

[D] =1 мс3 . Физический смысл коэффициента диффузии: он числен-

но равен массе вещества, переносимого через единичную площадку за 1 секунду при градиенте концентраций равном 1.

[I ] = 1		кг			, если [с] =1		кг		,
			2				3
		с × м					м
[I ] = 1		моль		, если [с] =1			моль
	с × м		2				м	3

88

Лекция 7.

Транспорт веществ через мембрану.

Являясь открытой термодинамической сиситемой, клетка постоянно осуществляет обмен веществом с окружающей средой. Такой обмен возможен благодаря способности клеток пропускать различные вещества через свою оболочку. Эта способность клеток называется проницаемостью.

Перемещение веществ в клетку или из неё в окружающую среду может осуществляться многими способами. В зависимости от того, что является источником энергии для переноса вещестыва, что является силой перемещения, все виды переноса веществ можно разделить на пассивный и активный транспорт.

Пассивный транспорт веществ.

Пассивный транспорт всегда осуществляется за счет энергии, сконцентрированной в каком-либо градиенте. Энергия метаболических процессов клеток (энергия гидролиза АТФ) на этот процесс непосредственно не переносится. Пассивный транспорт всегда идет от более высокого энергетического уровня к более низкому.

Основными градиентами, присущими живым организмам, являются градиенты концентрационные, электрические, осмотические, градиенты гидростатического давления.

В соответствии с этими градиентами имеются следующие виды пассивного транспорта веществ в клетках и тканях: диффузия, осмос, электроосмос, аномальный осмос, фильтрация.

Основным механизмом пассивного транспорта является диффузиясамопроизвольный процесс проникновения вещества из области большей концентрации в область ментшей концентрации в результате теплового хаотического движения.

Перенос незаряженных частиц (атомов и молекул) через мембрану

Очевидно, что при переносе незаряженных частиц единственным градиентом является градиент концентраций. Сле-

89

довательно, механизм переноса молекул и атомов через мембрану

– диффузия, а сам транспорт описывется уравнением Фика:

I = −D dcdx

Концентрационный градиент клеточной мембраны определить трудно, поэтому лучше использовать более простое уравнение, предложенное Коллендором и Берлундом и которое легко вывести из уравнения Фика.

ci - концентрация вещества в

клетке;

c0 - концентрация этого же

вещества снаружи клетки; cMi - концентрация этого же

вещества внутри клетки на границе клетка - мембрана; cMo - концентрация этого же

вещества внутри клетки на границе окружающая средамембрана.

ci > c0 . Следовательно, перенос идет из клетки в окружающую среду. Для мембраны

dc	=	c2	− c1	=	cMo − cMi	.
dx			l		l

Измерить cMi и cMo трудно, но зато экспериментально можно измерить ci и c0 . Кроме того, считают, что

cMi = cMo = k

ci co

k - коэффициент распределения частиц между мембраной и окружающей средой. Следовательно,

	cMo = kco ;		cMi = ci
Тогда
I = −D	cMo − cMi	= −	Dk(co − ci )	=	Dk(ci − co )	.
	l		l		l

Обозначим P = Dkl - проницаемость мембраны, получим

I= P(ci − co )

-это и есть уравнение Коллендора-Берлунда.

90