8. Генотерапия

Генотерапия – это совокупность методов лечения, основанных на переносе генетического материала в организм человека.

Основных подходов три:

1. доставка «нормального» гена в клетку;

2. «выключение» мутантного гена;

3. обратная мутация патологического аллеля.

Методы генной терапии разрабатывались удивительно быстро. Первый протокол генной терапии у человека был составлен в 1987 г., а с 1990 г. уже началась генная терапия больных. Осуществление генотерапии возможно двумя путями: через трансгеноз изолированных из организма соматических клеток в условиях in vitro (ex vivo) или через прямой трансгеноз клеток в организме больного (in vivo).

Трансгеноз (перенос генетического материала) ex vivo направлен на соматические клетки-мишени, заранее выделенные из организма (например, при резекции печени, пункции костного мозга; культура лимфоцитов, культура фибробластов).

Для введения ДНК в клетки человека разработаны многие методы: химические (обработка фосфатом кальция, диметилсульфоксидом); физические (микроинъекции, электропорация, бомбардировка частицами золота); вирусные (использование ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов). Наиболее эффективными переносчиками ДНК в клетки являются «природные шприцы» – вирусы.

Вирусные векторы более эффективно переносят встроенные в них генетические конструкции в клетки-мишени, при этом ретровирусы инфицируют делящиеся клетки и интегрируются случайным образом в их геном вместе со встроенными генетическими конструкциями, а аденовирусные векторы, напротив, трансфицируют неделящиеся клетки и не встраиваются в их геном. Аденоассоциированные вирусные векторы неслучайным образом встраиваются в определенный район хромосомы 19.

Все вирусы, кроме аденоассоциированного вируса, когда их используют в качестве векторов, подвергают генетической модификации, чтобы они утратили способность к самостоятельной репликации в клетке-хозяине, но сохранили способность инфицировать эти клетки.

Вирусные векторы обладают в большей или меньшей степени выраженным тропизмомк определенной ткани, что может быть использовано для направленной доставки генотерапевтической конструкции. Так, аденовирус тропен к эпителию дыхательных путей, вирус герпеса – к нейронам ЦНС.

Известны также «псевдовирусные» частицы: пэгилированные липосомы, полиплексы и всевозможные наночастицы.

Трансгеноз считается успешным, если не менее 5% всех обработанных клеток приобретут вводимый генетический материал.

Конечная процедура генотерапии ex vivo – это реимплантация трансгенных клеток. Она может быть органотропной (печеночные клетки вводятся через воротную вену) или эктопической (клетки костного мозга вводятся через вену).

Прямой трансгеноз (in vivo) осуществляется следующим образом. Создается рекомбинантный генетический вектор с заданным геном, необходимым для лечения. Его вводят в организм, после чего в клетках-мишенях происходит трансгеноз.

Приведем конкретные примеры генотерапии наследственных заболеваний у людей.

Недостаточность аденозиндезаминазы. Девочка 4 лет (Ашани ДеСильва, США) страдала редкой наследственной болезнью – первичным иммунодефицитом (тяжелая комбинированная форма), обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы (АДА). Все 4 года девочка жила в стерильном боксе. (Пациенты с этим заболеванием не переносят никаких контактов с любой инфекцией из-за тотального отсутствия иммунитета.)

Лимфоциты больной заранее были отделены от остальных элементов крови, Т-лимфоциты стимулированы к росту. Затем в условиях in vitro в них был введен ген АДА с помощью ретровирусного вектора. Приготовленные таким образом «генно-инженерные» лимфоциты были возвращены в кровоток.

Это событие произошло 14 сентября 1990 г., и эта дата считается «днем рождения» реальной генной терапии. Лечение этой больной было успешным. Общее количество лимфоцитов возросло до нормального уровня, а количество АДА-белка в Т-клетках увеличилось до 25% от нормы; этого количества оказалось достаточно для лечебного эффекта. В течение 6 месяцев перед очередным курсом лечения число «генно-инженерных» лимфоцитов и АДА-фермента в клетках оставалось постоянным. Из стерильного бокса девочку перевезли домой.

Выбор болезни для начала использования генотерапии был хорошо продуман. Ген АДА к этому времени был клонирован; его размеры – средние; он хорошо встраивается в ретровирусные векторы. Ранее при трансплантации костного мозга при АДА-недостаточности было показано, что ключевую роль в болезни играют Т-лимфоциты, поэтому именно на эти клетки-мишени и была направлена генотерапия.

Семейная гиперхолестеринемия. Рецепторы липопротеидов низкой плотности, играющих ключевую роль в обмене холестерина, синтезируются в клетках печени. Соответственно на гепатоциты (клетки-мишени) должна быть направлена генотерапия.

Попытка такого лечения была сделана в США у женщины 29 лет с резко выраженным атеросклерозом коронарных артерий. Эффект от предыдущего хирургического шунтирования отсутствовал. Брат больной уже умер от такой же болезни, не дожив до 30 лет. Генотерапия больной была проведена в несколько этапов.

Больной была сделана частичная (около 15%) гепатэктомия. Удаленную долю печени подвергли промыванию раствором коллагеназы для разделения гепатоцитов. Получили около 6 млн гепатоцитов. Затем эти клетки выращивали в 800 культуральных чашках на питательной среде. Во время выращивания в клетки печени передавали нормальный ген рецепторов липопротеидов, используя ретровирусный вектор.

Трансгенные гепатоциты были собраны и введены пациентке через катетер в воротную вену (чтобы клетки достигли печени). Через несколько месяцев при биопсии печени обнаружили, что новый ген функционирует в части клеток. Содержание липопротеидов в крови пациентки упало на 15-30%. Улучшение состояния больной позволило проводить лечение только лекарствами, снижающими уровень холестерина.

В течение последних 30 лет генная терапия продвинулась от преклинических до клинических исследований многих моногенных
болезней, в том числе: муковисцидоза; гемофилии А и В;
 хореи Гентингтона;
мышечной дистрофии Дюшенна;
 
семейной гиперхолестеринемии;
болезни Гоше
и др. Были использованы разные подходы генотерапии (in vivo и ех vivo) и различные
векторы. По большинству моногенных болезней клинические исследования проведены как пилотные на небольших выборках больных. По состоянию на 2007 г. всего в мире было проведено 1346 клинических испытаний протоколов генотерапии.

Рак. Необычайно быстрый прогресс в изучении генома человека и методов генной инженерии позволяет развивать генную терапию не только для моногенно наследуемых болезней, но также и для таких мультифакториальных болезней как рак. В настоящее время применяются следующие методические подходы к генотерапии рака.

1. Повышение иммуногенности опухолипутем вставки цитокиновых генов, генов, кодирующих антигены главного комплекса гистосовместимости и др.

2. Введение маркирующихгенов, которые могут обеспечивать выявление сохранившихся после операции фрагментов или разрастающихся опухолей.

3. Целенаправленное выключение онкогеновс использованием малых интерферирующих РНК или антисмысловой мРНК.

Область генотерапии рака переживает стадию «неуклюжего подростка». Это 
направление еще не достигло зрелости и, вероятно, обладает большим потенциалом. В Китае уже официально разрешены к применению два генотерапевтических
препарата для лечения тяжелых форм рака шеи и головы (гендицин и Н101).Эра генотерапии уже началась, и нет сомнений в том, что наследственные болезни и рак будут побеждены. Это вопрос времени.