- •Реферат
- •Перелік умовних позначень
- •Огляд літератури розділ 1
- •1.1. Виділення та ідентифікація біотехнологічно-перспективних штамів роду Nocardia
- •1.2. Використання представників роду Nocardia у деградації нафтових забруднень
- •1.2.1. Механізми споживання гідрофобних сполук мікроорганізмами
- •1.2.1.1. Роль поверхнево-активних речовин у асиміляції вуглеводнів
- •1.2.1.2. Гідрофобність клітин мікроорганізмів і споживання вуглеводнів
- •1.2.1.3. Міжфазне споживання гідрофобних сполук, якому сприяють поверхнево-активні речовини
- •1.2.1.4. Генетичні основи деградації вуглеводнів
- •1.2.2. Деградація аліфатичних вуглеводнів
- •1.2.3. Деградація ароматичних вуглеводнів
- •1.2.4. Деградація гетероциклічних сполук
- •1.2.5. Біодеградація складових нафти імобілізованими клітинами бактерій роду Nocardia
- •1.3. Біосинтез практично-важливих метаболітів
- •1.3.1. Представники роду Nocardia як продуценти антимікробних речовин
- •Антибіотичні речовини представників роду Nocardia
- •1.3.2. Біосинтез поверхнево-активних речовин
- •1.4. Використання поверхневого культивування для отримання цільових продуктів
- •1.5. Використання представників роду Nocardia у процесах біотрансформації
- •1.6. Дослідження біосинтезу нокобактину Nocardia farcinica ifm10152
- •Висновки до огляду літератури
- •Експериментальна частина розділ 2 матеріали і методи досліджень
- •2.1. Об’єкти досліджень
- •При рості на агаризованих середовищах штам n. Vaccinii к-8 на 24 год утворює колонії схожої структури та зовнішнього вигляду, зображено у таблиці. Культуральні ознаки штаму Nocardia vaccinii к-8
- •2.2. Культивування Nocardia vacсinii к-8
- •2.3. Визначення параметрів росту і синтезу поверхнево-активних речовин
- •2.3.4. Метод кількісного визначення поверхнево-активних речовин
- •2.4. Визначення хімічного складу пар за допомогою тонкошарової хроматографії
- •2.5. Статистична обробка експериментальних результатів
- •Розділ 3 вплив органічних кислот на синтез поверхнево-активних речовин штамом nocardia vacсinii k-8 за умов росту на гліцерині
- •3.1 Хімічний склад поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii k 8
- •3.2. Вибір попередників та синтез поверхнево-активних речовин залежно від моменту їх внесення
- •Залежність синтезу пар n. Vaccinii k-8 від моменту внесення та концентрації цитрату натрію
- •3.3. Визначення оптимальних концентрацій цитрату й фумарату натрію
- •Залежність синтезу пар n. Vaccinii k-8 від концентрації цитрату
- •Залежність синтезу пар n. Vaccinii k-8 від концентрації фумарату
- •3.4. Синтез поверхнево-активних речовин за спільного внесення органічних кислот
- •Синтез пар штамом n. Vaccinii k-8 під час спільного внесення фумарату й цитрату натрію
- •3.5. Вплив регуляції рН на синтез поверхнево-активних речовин
- •Вплив регуляції рН на вихід поверхнево-активних речовин n. Vaccinii k-8
- •3.6. Вплив якості інокуляту на синтез поверхнево-активних речовин за присутності попередників
- •Вплив якості інокуляту на синтез поверхнево-активних речовин n. Vaccinii k-8
- •Висновки до експериментальної частини
- •Розділ 4 охорона праці
- •4.1 Організація служби охорони праці в лабораторії
- •Аналіз виробничого травматизму
- •Санітарні умови праці на виробництві Мікроклімат
- •Загазованість
- •Запиленість повітря
- •Заходи захисту від шуму та вібрацій
- •Освітлення
- •Випромінювання
- •Висновки по матеріалам аналізу санітарних умов
- •4.2 Розрахунок штучної освітленості для науково-дослідної лабораторії Національного університету харчових технологій Загальне освітлення
- •Місцеве освітлення
- •Список використаної ліератури
- •Ксерокопії публікацій
1.4. Використання поверхневого культивування для отримання цільових продуктів
Останнім часом увагу дослідників привертає можливість використання методу твердофазного (поверхневого) культивування. Для багатьох продуцентів його використання є більш ефективним та менш затратним [41]. Також вирішується проблема надмірного піноутворення, яке знижує продуктивність процесу та підвищує ризик контамінації. Одним з способів вирішення даної проблеми може бути використання хімічного чи механічного піногасіння, проте ці методи не є дуже ефективними, значно підвищують вартість біореактора та операцій по очистці цільового продукту.
Kagliwal зі співавт. [35] було проведено дослідження використання поверхневого культивування для синтезу антибіотику цефаміцину штамом Nocardia lactamdurans, продуцентами якого також є Streptomyces cattleya, Streptomyces clavuligerus. Цефаміцин C належить до позаклітинних β-лактамних антибіотиків з гідрофільними властивостями. Останнім часом спостерігається набуття багатьма бактеріями резистентності до β-лактамів, зумовлене синтезом β-лактамази, що гідролізує β-лактамне кільце. Тому атом гідрогену цефаміцину заміщують на метильну групу у 7-α-положенні – і в результаті модифікована молекула набуває підвищеної стійкості до β-лактамази [35].
Для можливості використання даного процесу у промисловості необхідно було встановити оптимальні умови культивування. Під час оптимізації процесу було встановлено, що найвищі показники синтезу антибіотику (8,37 мг/гсс (грам сухого субстрату)) спостерігалися за використання соєвого борошна як джерела вуглецю. Причиною цього можу бути наявність у ньому високого вмісту білку (40%) та якісний склад амінокислот, серед яких найбільша кількість ізолейцину, лейцину, лізину, метионіну, цистину, фенілаланіну, тирозину, треоніну, валіну. Аналізуючи криву росту можна спостерігати, що значний синтез (2,34 мг/гсс) антибіотику розпочинався на другий день культивування і досягнув максимуму (8,47 мг/гсс), після чого поступово понижувався. Враховуючи інші дослідження, в ході яких вдалося отримати цефаміцин у кількостях 7,0 мг/гсс та 10,54 мг/гсс, припущено було можливість подальшої інтенсифікації [35].
На наступному етапі визначали оптимальний вміст вологи у середовищі, один з ключових факторів під час поверхневого культивування. Встановлено, що оптимальне значення цього параметру становило 65 %. За нижчих значень (37,5-55 %) при достатньому об’ємі доступного кисню спостерігали недостачу вологи для підтримання високої метаболічної активності та зайві витрати тепла мікроорганізмом. За значень вищих 65 % синтез продукту знижувався, що пов’язано з накопиченням великої кількості вологи між частинками субстрату, що гальмує розростання культури. Оптимізуючи джерело азоту було встановлено, що найвищі значення біосинтезу антибіотику були отримані для фосфату амонію (11,38 мг/гсс), та при величині рН=6,5 [35].
Враховуючи хімічну будову антибіотику досліджувався ефект додавання амінокислот у середовище культивування, так як першою стадією біосинтезу цефаміцину є конденсація α-аміноадипату (утворюється з L-лізину у дві стадії), L-цистеїну та L-валіну. Одним з вузьких місць біосинтезу антибіотику є лізин-6-амінотрансферазна реакція. Математичними методами оцінювали вплив лізину, валіну, цистеїну та метіоніну у трьох різних концентраціях на біосинтез антибіотику. Було виявлено, що цистеїн (у концентрації 1 %), метіонін (1,5 %) та валін (1,5 %) становлять найбільший інтерес для подальшої оптимізації. Тому на наступному етапі оцінювали синтез продукту залежно від різних концентрацій цих амінокислот та фосфату амонію. В ході оптимізації було досягнуто значення 15,75 мг/гсс.
Враховуючи літературні дані про позитивний вплив діамінів на біосинтез цефаміцину було проведено відповідний експеримент. Внесення 1,3-діамінопропану у концентрації 16 % дало змогу підвищити вихід антибіотику до 27,64 мг/гсс. Сприятливий вплив діамінопропану зумовлений активацією ним лізин-6-амінотрансферази та дегідрогенази, що відповідають за перетворення лізину до 2-аміноадипату. Таким чином усувається сайт метаболічного лімітування та підвищується біосинтез продукту [35].
Інше дослідження було здійснено з метою інтенсифікації біосинтезу поверхнево-активних речовин штамом N. lucentensis MSA04. Одніє з причин використання твердофазного культивування стали низькі результати підвищення біосинтезу ПАР, отримані при глибинному процесі [39].
В ході оптимізації поживного середовища було встановлено, що оптимальним джерелом вуглецю був гас, азоту – яловичий екстракт. Отриманий ПАР привертає увагу здатність знижувати поверхневий натяг до 16,34 мН/м, що значно вище за синтетичні ПАР (30,12 мН/м), а також високою термостабільністю (витримував температуру автоклавування – 121 °С). ПАР виявився більш стабільним у лужному середовищі порівняно з кислим. Особливо привернула увагу стійкість ПАР до високих концентрацій хориду натрію (5 %), в той час як хімічні аналоги, деактивуються у 2-3 % сольовому розчині [39].