1.6. Дослідження біосинтезу нокобактину Nocardia farcinica ifm10152
Створення банків геномних послідовностей та їх аналіз призводить до покращення розуміння природи мікроорганізмів, їхньої фізіології, еволюції та патогенності. Одним з перспективних напрямків є виявлення здатності до синтезу бактеріями цільових продуктів на підставі генних кластерів у геномі, що відповідають за утворення даної сполуки. Проте, попри ідентифікацію сотень генів натуральних продуктів, поки лише для декількох метаболітів ці дослідження проводилися досить детально, особливо для нерибосомальних пептидів (кодуються NRPS генами), таких як коеліхелін (Streptomyces coelicolor M145) та фускахеліну (Thermobifida fusca), що зумовлено їх хімічною структурою та, відповідно, простотою виявлення серед багатьох метаболітів шляхом сиквенування амінокислотної послідовності [36].
Вченими з Японії було просиквеновано геном Nocardia farcinica IFM10152, та виявлено наявність в ньому набагато більше генів, відповідних за синтез цільових продуктів, ніж попередньо традиційними методами, зокрема 14 NRPS та 7 PKS (полікетидсинтазних) послідовностей. Згідно результатів аналізу нуклеотидної послідовності частина генів (кластер 1 - nbtA,-B,-C,-D,-E,-F,-G,та-H; кластер 2 - nbtS,-T ) виявилася дуже близькою до аналогічної послідовності у Mycobacterium tuberculosis, що відповідає за синтез мікобактину. Тому в подальшому було проведено спроби по ізоляції гіпотетичного сідерофору з N. farcinica IFM10152. Масс-спектрометричними методами було виділено ідентифіковано дві сполуки: 10152A(C38H58N5O10) та 10152В (C40H62N5O10). За допомогою ЯМР-спектроскопії було встановлено, що це нокобактин, який продукує N. farcinica ATCC3313. Для представників роду Nocardia вже було ізольовано сідерофори формобактин, амамістан, бразілібактин, астеробактин, проте їх біосинтетичні гени ще не було просиквеновано [36]. Нокобактин складається з гідроксибензоату, N-гідрокси-N-ацетиллізину та N–гідрокси-ε-капролактаму, і відрізняється ноніловим (10152A) та ундециловим (10152В) боковими ланцюгами. Хочеться зазначити, що ще у 1973 р. з Nocardia asteroides ATCC 3318 було виділено подібну до мікобактину сполуку, здатну транспортувати йони заліза через ліпідну мембрану, що синтезувалася за пониженого вмісту феруму в середовищі [37].Кластер 1 відповідає за синтез всіх перелічених сполук крім N–гідрокси-ε-капролактаму, що походить від саліцилату. Тому було перевірено чи гени кластеру 2 відповідають за синтез саліцилату, а отже і нокобактину, шляхом перенесення nbtS послідовності у S. avermitilis, геном якого позбавлений саліцилатсинтазного гену. В результаті продукцію саліцилату здійснювали тільки трансформовані штами, що підтвердило припущення вчених. На наступному етапі дослідники сконструювали мутанти, позбавлені nbtA, nbtE та nbtS генів. Відмінностей у особливостях росту чи морфології помічено не було, проте у ΔnbtA та ΔnbtS варіантах синтез нокобактину знизився до 1 %, а у ΔnbtЕ взагалі припинився, проте було виявлено продукування подібної до нокобактину сполуки, позбавленої N –гідрокси-ε-капролактамної складової [36]. Дослідниками було запропоновано можливий шлях біосинтезу нокобактину (рис. 1.8.). Таким чином в ході даного дослідження вдалося встановити взаємозв’язок між генною послідовністю та хімічною структурою, вивити відповідальність гену за певну біохімічну реакцію та отримати раніше передбачуваний цільовий продукт.
