2.5. Статистична обробка експериментальних результатів

1. Визначення середнього значення одержаних результатів, тобто розрахунок середнього арифметичного

(3.1.)

2. Відхилення від середнього значення для кожного результату визначають за формулою 3.2:

∆

(3.2.)

Ці відхилення характеризують абсолютну помилку визначення. Випадкові помилки мають різні знаки. Коли значення результату досліду перевищує середнє значення, помилка вважається позитивною. Коли значення результату досліду менше середнього значення – негативною. Чим точніше проведено вимірювання, тим ближче значення окремих результатів і середнє значення.

3. Визначаємо дисперсію за формулою:

(3.3.)

4. Визначення стандартного відхилення окремого визначення:

(3.4.)

а також стандартного відхилення середнього результату

(3.5.)

5. Перевірка одержаних результатів за критерієм Стьюдента (t_α) для проведеного числа дослідів n при вибраній довірчій вірогідності (α=95 %). Критерій t_α з довірчою вірогідністю α показує, в скільки разів модуль різниці між істинним значенням визначаємої величини у і середнім значенням більше стандартного відхилення середнього результату:

(3.6.)

За додатком знайдемо значення t_α та використовуючи раніше одержане значення , розраховуємо достовірність одержаного середнього результату:

(3.7.)

6. Визначаємо інтервал, в якому з довірчою вірогідністю α буде знаходитись середній результат:

(3.8.)

7. Визначення відносної похибки

(3.9.)

Розділ 3 вплив органічних кислот на синтез поверхнево-активних речовин штамом nocardia vacсinii k-8 за умов росту на гліцерині

3.1 Хімічний склад поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii k 8

Для впровадження біотехнології N. vaccinii K-8 необхідно визначити хімічний склад синтезованих штамом поверхнево-активних речовин, так як в такому випадку ми, знаючи хімічну структуру сполук, можемо підібрати відповідні попередники, що будуть здатні інтенсифікувати синтез ПАР, а також оптимальні методи виділення і очищення цільового продукту.

Літературні дані щодо синтезу ПАР представниками роду Nocardia є досить обмеженими, а відомості про здатність до біосинтезу цих сполук на гліцерині взагалі відсутні. Відомо, що штам Nocardia sp. L-417 синтезує комплекс речовин з емульгувальними та поверхнево-активними властивостями під час росту на гексадекані, складовими яких є сполуки ліпідної природи [38]. Варто відмітити, що в сучасних оглядах літератури, присвячених мікробним ПАР, зустрічається інформація про здатність бактерій роду Nocardia до синтезу поверхнево-активних гліколіпідів, зокрема, трегалозоміколатів [45]. При цьому автори користуються інформацією кінця 80-х років ХХ ст., коли в літературі було описано штам Nocardia erythropolis – продуцент трегалозоміколатів. Проте дещо пізніше штам N. erythropolis було рекласифіковано як Rhodococcus erythropolis.

Для R. erythropolis ЕК-1 було виявлено, що штам синтезує як вільні, так і асоційовані з клітинною оболонкою речовини, що володіють поверхнево-активними і емульгувальними властивостями [10]. Основною складовою ПАР родококів є гліколіпіди, зокрема ідентифіковано трегалозомоно- і трегалозодикориноміколати. Відсутність трегалозоміколатів в складі асоційованих з клітиною ПАР під час вирощування на етанолі можна пояснити гідрофільністю цього субстрату, в той час як трегалозоміколати полегшують використання гідрофобних субстратів [2]. В складі ПАР, екстрагованих з культуральної рідини і клітин, виявлено також нейтральні ліпіди (тригліцерид, міколові кислоти, цетиловий спирт, пальмітинова кислота, метиловий ефір н-пентадеканової кислоти). Також було виявлено, що в складі ПАР присутні речовини полісахаридно-білкової будови (нейтральні моносахариди, глюкуронова кислота, білок, жирні кислоти) [10, 11].

Для A. calcoaceticus K-4 було виявлено, що синтезовані ним ПАР є комплексом гліколіпідів і аміноліпідів [9].

При проведенні ТШХ для N. vaccinii K-8 (дивись рис. 3.1.) провели ідентифікацію отриманих значень для нейтральних ліпідів та гліколіпідів за відомими значеннями коефіцієнту розподілу, результати наведені у табл. 3.1. [44].

а) б) в)

Рис 3.1. Визначення хімічного складу поверхнево-активних речовин N. vaccinii K-8:

а) – нейтральних ліпідів; б) – гліколіпідів; в) – аміноліпідів

Вдалося виявити присутність міколатів, триацилгліцеролів, диміколатів, п-алканових кислот, трегалозо-діацетилатів та трегалозо-6,6'-диміколатів. Певна кількість нейтральних ліпідів залишаються неідентифікованими. Результати наведено у табл. 3.1. Як бачимо, для ідентифікованих нейтральних та гліколіпідів не вдалося виявити залежність між способом підготовки проби та отриманими сполуками.

Таблиця 3.1

Характеристика ліпідів, синтезованих N. vaccinii K-8

Умови культивування	Препарат ПАР	Якісний склад
		Нейтральні ліпіди	Гліколіпіди
Без попередників	культуральна рідина	міколові кислоти триацилгліцероли n-алканові кислоти	трегалозо-діацелати трегалозо-6,6'-диміколати
	супернатант	міколові кислоти триацилгліцероли n-алканові кислоти	трегалозо-діацелати трегалозо-6,6'-диміколати
З внесенням 0,5 % цитрату натрію	супернатант	міколові кислоти триацилгліцероли n-алканові кислоти	трегалозо-діацелати трегалозо-6,6'-диміколати

Нейтральні ліпіди присутні у всіх мікробних клітинах та часто виділяються у середовище. Вони мають важливе значення для росту на вуглеводневих (гідрофобних) субстратах, так як здатні їх емульгувати і полегшувати доступ у клітину [2]. Привертає увагу здатність N. vaccinii K-8 синтезувати дані сполуки на гліцерині (гідрофільному субстраті), що підвищує його цінність, як потенційного продуцента ПАР [7].

Основною структурною одиницею гліколіпідів є молекула вуглеводу, етерифікована довголанцюговими аліфатичними чи гідроксиаліфатичними кислотами. Трегалозоліпіди містять у своєму складі сахарид трегалозу, приєднаний у положеннях С₆ та С₆’ до α-розгалуженої-β-гідроксикарбонової кислоти, відомої як міколат [2].

Поки не ідентифіковано аміноліпіди та частину гліколіпідів у зв’язку з відсутністю необхідних даних. Отримані значення коефіцієнтів розподілу наведено у табл. 3.2. Так як ПАР близьких до N. vaccinii K-8 штамів складаються з ліпідів, то було прийнято рішення в одному з варіантів додати регулятор синтезу ліпідів – цитрат, механізм дії якого розглядатиметься у наступному підрозділі. Наявність аміноліпідів може свідчити про потенційні антимікробні властивості штаму, так як більшість ліпопептидів є антибіотиками [2].

Таблиця 3.2

Одержані значення коефіцієнту розподілу для ліпопептидів та гліколіпідів

Умови культивування	Аміноліпіди	Гліколіпіди
Без цитрату	0,34; 0,89	0,1; 0,52; 0,77; 0,89
З додаванням 0,5% цитрату натрію	0,07; 0,21; 0,41; 0,78; 0,89	0,1; 0,52; 0,77; 0,,89

Аналізуючи отримані під час ідентифікації аміноліпідів та нейтральних ліпідів дані, можна звернути увагу на ряд сполук (R_f=0,07;0,21;0,41), що може свідчити про стимулювальний вплив цитрату на певну групу поверхнево-активних речовин.

Отже, ПАР, синтезовані штамом N. vaccinii K-8 за є комплексом нейтральних ліпідів, гліколіпідів та аміноліпідів. Залежності хімічної структури від способу підготовки проб, за винятком деяких випадків, простежити не вдалося, проте було виявлено сполуки, що синтезуються лише за наявності цитрату натрію.