2.3.4. Метод кількісного визначення поверхнево-активних речовин

Кількість ПАР в супернатанті (г/л) визначали ваговим методом після екстракції поверхнево-активних ліпідів модифікованою сумішшю Фолча. Культуральну рідину, отриману після культивування N. vaccinii K-8, центрифугували при 5000g протягом 20 хв для відділення біомаси. 25 мл супернатанту поміщали в циліндричну ділильну воронку об’ємом 100 мл,

Залежність поверхневого натягу супернатанту культуральної рідини від розведення

додавали 5 мл 1М HCl, воронку закривали пришліфованою пробкою і струшували 3 хв, потім додавали ще 4 мл 1М HCl і 16 мл суміші хлороформа і метанола (2:1) і струшували (з метою екстракції ліпідів) протягом 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишали в воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирали (органічний екстракт 1), а водну фазу піддавали повторній екстракції. При повторній екстракції до водної фази додавали 9 мл 1М HCl і 16 мл суміші хлороформа і метанолу (2:1) і проводили екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз, збирали нижню фракцію і отримували органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додавали 25 мл суміші хлороформу і метанолу (2:1) і здійснювали екстракцію, як описано вище, отримуючи органічний екстракт 3. В разі утворення фракції емульгатора її центрифугавали при 5000g протягом 10 хв, та нижню органічну фракцію додавали до органічного екстракту, а верхню водну фазу піддавали подальшій екстракції. Екстракти 1-3 змішували і упарювали на роторній випарній установці ИР-1М2 (Росія) при температурі 50ºС і абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси.

2.3.5. Емульгувальні властивості досліджуваних зразків визначали за наступним методом. Як субстрат для емульгування використовували соняшникову олію. До 2 мл культуральної рідини, додавали 2 мл олії та струшували упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е₂₄) проводять через 24 год, як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражали у відсотках.

2.3.6. Якісна реакція на гліцерин. Для визначення залишкової кількості гліцерину в постферментаційній рідині проводили реакцію взаємодії культуральної рідини з гідроксидом міді.

При взаємодії гідроксиду міді з багатоатомними спиртами відбувається розчинення гідроксиду і утворюється комплексна сполука синього кольору.

2.4. Визначення хімічного складу пар за допомогою тонкошарової хроматографії

Для визначення хімічного складу ПАР проводили тонкошарову хроматографію на силуфолових пластинках фірми Kavalier чеського виробника (розмір 150∙150 мм та 75∙150 мм) у полярній та неполярній системах.

Підготовка систем для хроматографії. Полярну систему готували змішуванням хлороформу, метанолу і води у співвідношенні 65:15:2. Неполярна система складалася з гексану і діетилового ефіру у співвідношенні 2:1.

Приготування пластинок. Попередньо на пластинки нанесли лінії старту та фінішу на відстані 1,3 см від нижнього та верхнього країв відповідно. На лінії старту було позначено точки для нанесення проб.

Приготування камери для хроматографії. Камеру для хроматографії вистиляли зсередини по периметру фільтрувальним папером, добавляли систему та накривали скляною кришкою. Камера готова до хроматографії, коли фільтрувальний папір повністю змочений системою.

Приготування барвників. Готували розчин наступних барвників:

• фосфо-молібденової кислоти для виявлення нейтральних ліпідів (5% у етанолі). Для цього 1,25 г кислоти розчиняли у 25 мл етанолу. Виявлення ліпідів за допомогою фосфомолібденової кислоти базується на утворенні комплексної сполуки жовтого кольору.

• нінгідрину – для вивлення пептидоліпідів та білків (1% у етанолі). Для цього 0,25 г кислоти розчиняли у 25 мл етанолу. Під час реакції нінгідрину з α-амінокислотою утворюється комплексна сполука синьо-фіолетового кольору (пурпур Руеманна).

+ =

Нінгідрин α-амінокислота пурпур Руеманна

- антроновий реактив – для виявлення гліколіпідів (0,5 г антрону розчиняли у 25 мл концентрованої сульфатної кислоти та доводили до об’єму 50 мл метанолом). Метод базується на дегідратації вуглеводу сильною кислотою з утворенням фурфуролу, та реакцією комплексоутворення останнього з антроновим реактивом

Комплексна

сполука

вуглевод фурфурол

Розчинення препарату ПАР. У круглодонну колбу з попередньо отриманим препаратом ПАР (культивування N. vacсinii К-8 у на середовищі №1 – проба 1, та з додаванням 0,5% розчину цитрату натрію – 2 і 3) добавляли 10 мл дистильованої води і перемішували для розчинення ПАР. Потім добавляли 10 мл суміші Фолча і екстрагували. Нижню фракцію відділяли шприцем і переносили в іншу колбу (екстракт 1). До колби з ПАР добавляли ще 5 мл суміші Фолча, повторно екстрагували, аналогічно відділяли нижню фракцію і добавляли до екстракту 1. Екстракт 1 випарювали на роторній випарній установці і наносили на пластинку для хроматографії.

Хроматографія на пластинках. На підготовлені пластинки наносили кінчиком піпетки проби. Пластинку поміщали у камеру для хроматографії,

заповнену системою розчинників. Витримували пластинку в камері доки система не піднімалася до лінії фінішу.

Проявлення пластинок. Пластинки обробляли барвниками та проявляли у сухожаровій шафі при температурі 100-120ºС протягом 15-20 хв.

Ідентифікація. Після проявлення хроматограм обчислювали значення коефіцієнту розподілу – відношення відстані, що пройшла дана сполука до відстані, що пройшов розчинник від лінії старту до лінії фінішу (R_f=l_реч/l_заг ) для кожної виявленої сполуки, та порівнювали з табличними значеннями для відомих речовин [44].