1.3. Біосинтез практично-важливих метаболітів

1.3.1. Представники роду Nocardia як продуценти антимікробних речовин

Одним з головних і перспективних джерел нових лікарських засобів є вторинні метаболіти мікроорганізмів. Особливу увагу серед останніх привертають сполуки, синтезовані мікроорганізмами класу Actinobacteria завдяки антибактеріальним, фунгіцидним, антиоксидантним, протипухлинним та противірусним властивостями. Тому в останні роки збільшилася кількість досліджень, спрямованих на ізоляцію, ідентифікацію та біологічну оцінку сполук, що синтезуються рідкісними та патогенними актиноміцетами. З понад близько 10 000 виділених антибіотиків більшість синтезуються представниками роду Streptomyces, що домінує у ґрунтових екосистемах [17, 19]. Проте набуття багатьма патогенними мікроорганізмами стійкості до вже існуючих лікарських засобів вимагає пошуку нових протимікробних препаратів. Так, велику кількість метаболітів з антибіотичними властивостями було виявлено у представників роду Nocardia.

Дослідниками було виділено та ідентифіковано штам Nocardia levis MK-VL 113, здатний синтезувати біологічно-активні сполуки [17]. З метою їх виділення та ідентифікації отриману культуральну рідину після культивування на мінеральному середовищі з сахарозою та триптоном піддавали екстракції етилацетатом та проводили подальше хроматографічне дослідження, в ході якого було виявлено ряд сполук: біс-(2-етилгексил) фталат, біс-(5-етилгептил) фталату (рис. 1.5.), 1,8-октандикарбонову кислоту, 2,6-піпередонмонооксим, 1-ейкозанол, гексадеканову кислоту та інші [17].

Рис. 1.5. Хімічна структура біс-(2-етилгексил) фталату (а) та біс-(5-етилгептил) фталату

Для біс-(2-етилгексил) фталату та біс-(5-етилгептил) фталату (сполук, виділених з першої підфракції) проводили визначення антимікробної дії, в ході якого було встановлено, що біс-(2-етилгексил) фталат ефективніше пригнічує розвиток інших мікроорганізмів. Найбільш чутливим до даних сполук серед умовно патогенних та патогенних мікроорганізмів виявився Staphilococcus aureus, дещо нижчі значення були отримані для Bacillus cereus та Staphilococcus epidermis. Серед грибів дані метаболіти найактивніше пригнічували ріст Aspergillus niger та Fusarium Oxysporum. Також біс-(2-етилгексил) фталат показав високу антимікробну активність проти Candida albicans, порівняно з біс-(5-етилгептил) фталатом та гризеофульвіном як стандартом. Хоча є досить багато даних про біосинтез біс-(2-етилгексил) фталату мікроорганізмами, проте для роду Nocardia здатність синтезувати цю сполуку було показано вперше, як і здатність мікроорганізмами продукувати біс-(5-етилгептил) фталат [17].

В іншому дослідженні було виділено штам Nocardia sp. ALAA 2000 та встановлено його здатність синтезувати біологічно-активні сполуки [19]. Було ідентифіковано хризофанолу 8-метиловий ефір, асфоделін-4,7-біхризофанол, юстицидин Б та нову біологічно-активну сполуку - аяміцин (1,1-дихлоро-4-етил-5-(4-нітрофеніл)-гексан-2-он ) (рис. 1.6.), особливість якої полягає у наявності одночасно як дихлор-, так і нітрогруп. Дослідниками було проведено оптимізацію умов культивування, і встановлено, що найвищі значення антимікробної активності спостерігаються при використанні крохмалю, гліцеролу та глюкози як джерел вуглецю, та кукурудзяного і дріжджового екстрактів як джерел азоту. Синтез антибіотика підвищувався при збільшенні рН до 7,5 та температури до 35 °С [19].

Рис. 1.6. Кристалічна будова аяміцину

Було здійснено ферментацію Nocardia sp. ALAA 2000 у експериментальному ферментері місткістю 10 л. Утворення метаболітів починалося на третій день культивування і досягало максимуму на сьомий. Для виділених сполук провели дослідження їх антимікробної активності проти широкого кола штамів мікроорганізмів (Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus cereus ATCC 9634, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Micrococcus luteus ATCC 9341, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Corynebacterium xerosis NRRL B-1397, Rhodotorula acuta, Pichia angusta, Candida albicans), в ході якого були отримані різні значення даної величини, пригнічення життєдіяльності спостерігалося за концентрації 0,1-10 мг/мл. Аяміцин проявляв найвищу активність і пригнічував ріст мікроорганізмів за значень власної концентрації від 0,1 до 0,5 мг/мл [19].

Велику групу речовин із антимікробними властивостями утворюють різні штами людського патогенну Nocardia brasiliensis [31-33]. У 1997 р. японськими вченими було проведено дослідження, в якому з 76 штамів 18 метанолових екстрактів та 4 культуральні фільтрати проявили антибіотичну активність [32]. Серед даних сполук було виявлено антибіотик бразилідин А, індоловий алкалоїд за хімічною структурою. Було встановлено його антимікробну активність по відношенню до грибів та мікроорганізмів, і, таким чином, вперше було показано здатність представників роду Nocardia до синтезу антибіотиків. У наступних дослідженнях було ідентифіковано інші речовини, зокрема нокарацин, бразиліхінон D, продуцентом яких є штам N. brasiliensis IFM 0667, та бразилібактин А (штам IFM 0995). Нокарацини складаються з бензоїдної структури з гераніловим боковим ланцюгом, а бразиліхінон D є етильованим бензантрахіноном [32]. Окрім антимікробних властивостей для даних сполук було виявлено цитотоксичні властивості. Так, нокарацини здатні пригнічувати ріст in vitro онкоклітин людської лейкемії, а для бразиліхінону встановлено здатність, хоч і невисоку, руйнувати клітини мишачої лейкемії L1210 та клітини КВ раку шкіри людини, що робить дані штами потенційними продуцентами протиракових препаратів.

В іншому дослідженні виявлено здатність штаму N. brasiliensis sp. Продукувати сполуку, активну проти патогену риб Vibrio damsela, здатного спричиняти у останніх кишкову інфекцію, що і стає причиною їх масових загибель, та, відповідно, економічних збитків [33]. В ході даного дослідження, використовуючи методи математичного планування експерименту, було оптимізовано поживне середовище зниженням концентрацій всіх його елементів, окрім сульфату магнію, підвищення концентрації якого сприяло синтезу антибіотику. Найвища антагоністична активність спостерігалася за рН=8 та температури 40º С. В ході проведеної роботи вдалося збільшити зону інгібування тест-штаму з 10 до 17 мм [33].

Близький до вищезазначеного, штам Nocardia pseudobrasiliensis IFM 0757, синтезує тіопептидний антибіотик нокардітіацин, що проявляє специфічну активність по відношенню до кислотостійких грампозитивних бактерій [34]. Узагальнена інформація про здатність представників роду Nocardia синтезувати антибіотичні речовини наведена у табл. 1.2 [17-19, 31-37]

Таблиця 1.2