Реакция торможения гемагглютинации

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках плексигласовых планшет готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей в объеме 0,5 мл, добавляя к ним по 0,25 мл 2 % взвеси трижды отмытых изотоническим раствором натрия хлорида эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации 0,5 мл эритроцитов смешивают с равным объемом изотонического раствора натрия хлорида Смеси инкубирую г в термостате при температуре 37 °С, при комнатной температуре или же при температуре 4 °С.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «+++–»–» – звездчатой формы осадок с фестончатыми краями в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Рис. 34 Реакция торможения гемагглютинации

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью ре акции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по 0,25 мл. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости, при типировании вируса гриппа, например, в четырехкратном титре, т. е. 4 гемагглютинирующие единицы. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют по 0,5 мл 1 % взвеси эритроцитов. Спустя 30–45 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т. е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее рекомендуется так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз (рис. 34).

Раздел 2 инфекционная микробиология возбудители бактериальных инфекций пиогенные кокки

Болезнетворными для человека являются четыре вида гноеродных (пиогенных) кокков: Staphilococcus aureus, Staphilococcus pyogenes, Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.

Клиника и эпидемиология гнойных инфекций. Стафилококки и стрептококки, обладая сродством к различным тканям, вызывают воспалительные процессы кожи, подкожной клетчатки и слизистых оболочек (фурункулы, карбункулы, абсцессы, панариции, маститы, конъюнктивиты, блефариты), костной системы (остеомиелиты), внутренних органов (пневмонии, аппендициты, пиелонефриты, холециститы), воспаление твердой мозговой оболочки (менингиты), брюшины (перитониты), а также сепсис. Они осложняют течение гриппа, кори и других инфекционных заболеваний, вызывают послеоперационные и послеродовые нагноения. Вместе с тем стрептококк является этиологическим фактором рожи, подострого септического эндокардита, возможно, скарлатины и ревматизма. У гонококка и менингококка органотропность выражена резче. Так, менингококк вызывает назофарингит, менингококкемию, менингит, менингоэнцефалит, а гонококк – гонорею и бленнорею у новорожденных.

Большинство заболеваний, вызываемых патогенными кокками, малозаразны. Эпидемически распространяются менингококковая инфекция, скарлатина, рожа, гонорея. Источники инфекции – здоровые носители и больные люди. Механизмы передачи разнообразны, но преобладает воздушно–капельный. Исключение составляет гонорея, передающаяся от больного человека при половом контакте. Восприимчивость людей к гнойным инфекциям неодинакова. В отношении стафило– и стрептококковых инфекций человек обладает высокой степенью резистентности, иммунитет отсутствует лишь к гонорее.

Биологические особенности патогенных кокков. Морфологические свойства. Пиогенные кокки имеют шаровидную (стафилококк), овальную (стрептококк) или бобовидную (менингококк и гонококк) форму. Размеры их варьируют в среднем от 0,6 до 1 мкм. В мазках из культур стафилококки располагаются преимущественно в виде гроздей винограда, стрептококки – цепочками, менингококки и гонококки – попарно или тетрадами, в которых вогнутые стороны обращены внутрь (см. рис. 9). В препаратах, приготовленных из гноя, стафилококки и стрептококки относительно нейтрофилов располагаются обычно внеклеточно, а менингококки и гонококки – преимущественно интрацеллюлярно. Среди патогенных кокков капсулу формируют менингококки и некоторые стрептококки. Все четыре вида патогенных кокков спор и жгутиков не образуют. По Граму стафилококки и стрептококки окрашиваются положительно, менингококки и гонококки – отрицательно.

Культивирование. Патогенные кокки – факультативные анаэробы. Исключение составляют некоторые разновидности анаэробных стрептококков. Оптимальной температурой роста для них является 37С, а рН среды – 7,2–7,6. Для культивирования стафилококка используют мясопептонные бульон и агар. Остальные патогенные кокки выращивают на сложных питательных средах, составленных на основе бульона и питательного агара с прибавлением к ним глюкозы, сыворотки, асцитической жидкости, крови.

Стафилококки на пластинчатом питательном агаре через сутки вырастают в виде выпуклых, с ровными краями, непрозрачных пигментированных колоний размером 1–4 мм. По окраске колоний различают золотистые, белые, лимонно–желтые стафилококки. Пигменты стафилококка быстро образуются при хорошей аэрации, на рассеянном свету. На кровяном агаре колонии золотистого стафилококка вызывают гемолиз.

Стрептококки на сахарном, сывороточном, асцитическом питательных агарах дают мелкие (до 1 мм) мутные серовато–белые или бесцветные колонии. На кровяном агаре они окружены четко выраженной прозрачной зоной гемолиза (β–гемолитические варианты) или узкой мутно–зеленоватой каймой (α–гемолитические стрептококки). Невирулентный стрептококк гемолиза не вызывает (негемолитический вариант).

Менингококки и гонококки на излюбленных для них средах формируют точечные колонии. При этом через 24 ч от момента посева менингококки на сывороточном агаре образуют полушаровидные влажные бесцветные колонии, а гонококки на агаре с асцитической жидкостью – рисовидные колонии.

Характер роста пиогенных кокков на жидких средах тоже отличается. Так, стафилококк и менингококк вызывают диффузное помутнение мясопептонного бульона. Гонококк вызывает едва заметное помутнение бульона, а стрептококк его совсем не изменяет, вырастая в виде зерен на стенках и дне пробирки.

Биохимические свойства. Грамположительные стафилококки и стрептококки обладают большим набором ферментов, чем грамотрицательные менингококки и гонококки. Они расщепляют все углеводы короткого ряда Гисса и свертывают молоко, а стафилококк, кроме того, разжижает желатину, образует индол, аммиак, сероводород, восстанавливает нитраты в нитриты. Менингококк ферментирует глюкозу и мальтозу, гонококк – только глюкозу.

Токсины и агрессины. Стафилококки и стрептококки продуцируют экзотоксины, обладающие свойством лизировать эритроциты и оказывать цитотоксическое действие, разрушать полиморфноядерные нейтрофилы (лейкоцидины), вызывать некроз кожи (некротоксины) и смерть животных (летальные токсины). Некоторые штаммы стафилококка выделяют эксфолиатины, поражающие кожные покровы у детей, и энтеротоксины, вызывающие пищевые отравления. Стрептококки больных скарлатиной продуцируют эритрогенный яд. Кроме экзотоксина, стафилококки и стрептококки образуют целый ряд ферментов инвазивности и агрессивности.

Болезнетворные свойства менингококков и гонококков обусловлены эндотоксинами, образующимися при их разрушении.

Классификация патогенных кокков. Род Staphilococcus включает более десяти видов. Чаще всего заболевания вызывает золотистый стафилококк. Он отличается тем, что образует на мясопептонном агаре золотистого цвета колонии, гемолизирующие кровь; способен окислять в анаэробных условиях маннит; продуцирует гиалуронидазу, лецитиназу, фибринолйзин и главное – коагулазу, нуклеазу, α–токсин.

Стрептококки по структуре С–полисахарида разделяются на группы от А до Н и от К до Т. При этом отмечено, что заболевание у людей вызывают преимущественно стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes), которые вырабатывают β–гемолизин, образуют растворимый токсин и, так же как стафилококки, обладают многими ферментами агрессивности.

Другим видом патогенного стрептококка является Streptococcus pneumoniae, вызывающий катары верхних дыхательных путей и крупозную пневмонию. Он представляет собой ланцетовидной формы грамположительный диплококк, образующий в организме человека капсулу.

Иногда из гангренозных ран и крови при сепсисе выделяются анаэробные виды стрептококков, а при дисфункциях кишечника – условно–патогенные энтерококки.

Менингококки классифицируют по тому же принципу, что и стрептококки, на А, В, С, В, X, У, 2, 29Е и W135 серогруппы. Антигенная структура гонококков тоже неоднородна, но их серологическая дифференциация не закончена.

Лабораторная диагностика гнойных инфекций. При стафило– и стрептококковых инфекциях объектами исследования могут быть гной, воспалительные экссудаты, отделяемое носоглотки, мокрота, моча, кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (главным образом, молочные, торты, пирожные). При менингококковых инфекциях исследованию подлежат налет с задних дужек миндалин, спинномозговая жидкость и кровь, при гонорее – отделяемое уретры, влагалища, шейки матки, предстательной железы, конъюнктивы (бленнорея) сперма, моча.

Бактериоскопический метод. Обычная микроскопия патологического материала исчерпывающий ответ дает только в отношении острой гонореи, при которой в окрашенных по Граму или метиленовым синим мазках из выделений уретры обнаруживаются многочисленные диплококки, расположенные преимущественно в нейтрофилах. Сходная картина выявляется при микроскопии спинномозговой жидкости в случае менингококкового менингита. В выделениях длительно леченных больных и лиц, страдающих хронической гонореей, гонококки утрачивают характерную форму и размеры, превращаясь в крупные шары и мелкие «пылинки», неодинаково окрашивающиеся по Граму. То же происходит с менингококком, но в гораздо меньшей степени. Морфология стафилококка и стрептококка более стабильна, но их микроскопическая идентификация все–таки мало надежна.

Бактериологический метод. Чистую культуру выделяют с учетом питательных потребностей и биологических свойств патогенных кокков. Так, стафилококки и стрептококки лучше растут на сахарном и кровяном агарах. Из сильно загрязненных материалов стафилококки выделяют на агаре с 10–20% желточной взвеси и 10% натрия хлорида, а стрептококк – на кровяном агаре с генцианвиолетом, который подавляет рост посторонней микрофлоры.

Выделить в чистой культуре менингококки и гонококки гораздо труднее. Так как они быстро отмирают вне организма, то патологический материал должен предохраняться от охлаждения и по возможности скорее засеваться на свежеприготовленные и подогретые среды. Процент высеваемости менингококков увеличивается в атмосфере высокой влажности и повышенной концентрации диоксида углерода. С той же целью в питательные среды при их выращивании добавляют линкомицин, ристомицин и полимиксин М, бактерицидно действующие на сопутствующие непатогенные грамположительные микробы.

Для выделения гемокультуры пиогенных кокков при сепсисе 10 мл крови больных засевают в 100 мл сахарного или сывороточного бульона.

Идентификация кокков, определение их вирулентности и антибиотикочувствительности. Видовую принадлежность патогенных кокков устанавливают по морфолого–культуральным и биохимическим свойствам. Нередко прибегают к исследованию вирулентности и токсигенности. Высоковирулентными для белых мышей являются стафилококки и стрептококки. При внутрикожном введении кролику взвеси стафилококков и стрептококков возникает местная воспалительная реакция, часто с некрозом (положительная дермонекротическая проба). К менингококку и гонококку экспериментальные животные невосприимчивы.

Выделенную культуру патогенных кокков необходимо исследовать на чувствительность к ряду антибиотиков. Особенно важно получить антибиотикограмму для стафилококков, среди которых часто встречаются штаммы не только с высокой антибиотикоустойчивостью, но и с полирезистентностью к различным сульфаниламидам.

Серодиагностика. Для диагностики менингококкового менингита применяется реакция преципитации со спинномозговой жидкостью. Хроническая форма гонореи расшифровывается с помощью РСК.

Биологический метод. Иногда для выделения чистой культуры стафилококков и стрептококков, ускорения их дифференциации исследование начинают с заражения материалом белых мышей. Павших животных вскрывают и капельку крови сердца засевают на сахарный и кровяной агары, получая таким образом через сутки чистую культуру.

Профилактика и лечение гнойных инфекций. Специфическая профилактика инфекций, вызываемых патогенными кокками, разработана недостаточно. Имеется химическая противоменингококковая вакцина из группоспецифических полисахаридов серогрупп А и С, которая применяется по эпидемическим показаниям. Для предупреждения гонококковой бленнореи в конъюнктивальный мешок новорожденных вводят 2 капли 2% нитрата серебра или свежеприготовленного 3% масляного раствора пенициллина.

Лечение гнойных инфекций проводят бензилпенициллином и его полусинтетическими аналогами, аминогликозидами, тетрациклинами, макролидами, фузидином, рифампицином, рондомицином. В терапии стафило– и стрептококковых инфекций применяются антистафилококковые иммуноглобулин и гипериммунная плазма, анатоксин, стафилококковые фаги. Для лечения рецидивирующих гнойных заболеваний и хронической гонореи готовят поливалентные аутовакцины.