Особенности выделения и изучения культуральных свойств бактерий–анаэробов

Бактерии–анаэробы выращивают при пониженном содержании кислорода, облигатные – при полном его отсутствии, что достигается путем посева материалов внутрь жидкой или полутвердой питательной среды.

Рис. 19. Микроанаэростат

Условия культивирования. Наиболее пригодной для выращивания бактерий–анаэробов является среда Китта– Тароцци (среда обогащения), состоящая из концентрированного МПБ, глюкозы и 0,15 % агара (рН 7,2–7,4). На дно пробирки для адсорбции кислорода помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1,0–1,5 см и заливают 6–7 мл среды. Перед посевом среду «регенерируют» (кипятят 10–15 мин для удаления воздуха), затем быстро охлаждают, а после посева заливают стерильным вазелиновым маслом. Материал, содержащий спороносные анаэробы, высевают в две пробирки со средой Китта–Тароцци, одну из них прогревают 30 мин при температуре 80°С для уничтожения вегетативных форм сопутствующей микрофлоры.

Посевы на поверхности плотных сред, разлитых в чашки Петри, культивируют в макро– или микроанаэростате.

Макроанаэростат представляет собой двухстенный аппарат с крышкой. Между стенками аппарата находится вода, источником тепла служит электричество, терморегулятор обеспечивает постоянную температуру. Посевы помещают в анаэростат после того, как температура в нем будет доведена до 37 °С, и герметически закрывают крышкой. Анаэростат соединяют с вакуум–насосом и, выкачивая воздух, создают вакуум 3–5 мм. Посевы инкубируют в анаэростате обычно в течение 48 ч.

Имеются также портативные анаэростаты (рис. 19). Это небольшие металлические цилиндры с герметически закрывающейся крышкой, постоянная температура в которых создается при помещении их в термостат.

Особенности выделения бактерий–анаэробов. В первый день исследуемый материал микроскопируют и высевают в среду Китта–Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой, прогревают при температуре 80С в течение 30 мин, заливают вазелиновым маслом и посевы помещают в термостат.

На второй день помутневшую (нередко вспенившуюся) среду обогащения набирают пастеровской пипеткой, которую опускают через слой вазелинового масла до дна пробирки. Масло со стенок пипетки удаляют стерильной ватой при помощи пинцета над сосудом с дезинфицирующим раствором.

Выделенную культуру микроскопируют и пересевают на плотные питательные среды. Изолированные колонии получают последовательным засевом шпателем бульонной культуры в три чашки Петри с кровяно–сахарным агаром. Чашки Петри помещают в анаэростат при температуре 37С на 24–48 ч (метод Цейсслера) или культуру засевают в столбики расплавленных и остуженных сахарных агаров после предварительного разведения в изотоническом растворе натрия хлорида пастеровской пипеткой с запаянным концом (метод Вейнберга).

На третьи сутки изучают выросшие на чашках Петри колонии, делают из них мазки, высевают на среду Китта–Тароцци для обогащения чистой культуры Колонии из столбиков агара извлекают пастеровской пипеткой, микроскопируют и тоже высевают на среду Китта–Тароцци

Чтобы установить видовую принадлежность выделенной культуры бактерий, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей, необходимо определить на ряде Гисса их ферментативные свойства.