Морфология и ультраструктура прокариот эубактерии

Бактерии – одноклеточные бесхлорофильные организмы размером от 0,2 до 10 мкм, характеризующиеся всеми свойствами прокариот. Они имеют очень низкую степень дифференциации и состоят из неструктурированного ядра, цитоплазмы, цитоплазматической мембраны, клеточной стенки. Некоторые бактерии имеют жгутики, ворсинки, капсулы и способны образовывать эндоспоры.

Ядро. Функцию ядра у бактерий выполняет циркулярно замкнутая и сильно скрученная компактно уложенная молекула ДНК. Такое неотграниченное мембраной ядро называют нуклеоидом, а в генетике – геномом или хромосомой. Обычно в покоящихся бактериях содержится один нуклеоид в виде плотного тела неправильных очертаний, которое может быть обнаружено при специальном методе обработки мазка или выявлено при электронно–микроскопических исследованиях ультратонких срезов бактерий.

Цитоплазма. Это коллоидная смесь полисахаридов, липидов, белков и других соединений. У многих видов бактерий в ней содержатся эквивалентные (идентичные) нуклеоиду небольшие циркулярно замкнутые молекулы ДНК, или плазмиды, детерминирующие образование ферментов, которые расщепляют многие антибиотики, сульфаниламиды и другие антимикробные вещества. В цитоплазме находятся также рибосомы и запасные внутриклеточные вещества, такие, например, как отложения поли–(бета)–оксибутирата у возбудителей кишечных инфекций и зерна волютина (полифосфаты) на концах коринебактерий дифтерии. При окраске щелочным метиленовым синим по Леффлеру (3–5 мин) гранулы волютина у дифтерийных коринебактерий приобретают темно–синий, а палочка –голубой цвет. При окраске по Нейссеру они окрашиваются в сине–черный, а бактерия – в желтый цвет. Мазок окрашивают: 1) 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий – 0,1 г, спирт – 2 мл, ледяная уксусная кислота – 5 мл, дистиллированная вода – 100 мл); 2) сливают краситель и мазок промывают водой; 3) на 20– 30 с наносят раствор Люголя; 4) 1 –3 мин окрашивают везувином (прокипяченная и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл спирта и 40 мл дистиллированной воды).

Цитоплазматическая мембрана. Представляет собой обособленную от клеточной стенки и цитоплазмы полупроницаемую структуру толщиной 5–10 нм, состоящую из двойного слоя фосфолипидов, пронизанных белковыми молекулами. Она служит осмотическим барьером и главным местом метаболической активности бактерий. С нею связаны пермеазы, которые осуществляют транспорт питательных веществ, и ферменты синтеза различных классов макромолекул, в том числе основного компонента клеточной стенки – пептидогликана. При впячивании цитоплазматической мембраны внутрь клетки образуются мезосомы, которые выполняют функцию генераторов энергии и участвуют в репликации ДНК и построении поперечной перегородки при делении бактерий.

Клеточная стенка. Это внешняя структура бактерий толщиной 10– 35 нм, отделенная от цитоплазматической мембраны очень узким ободком периплазматического пространства. Она несет в основном формообразующую и защитную функции.

Главным компонентом клеточной стенки бактерий является особый, только им присущий гетерополимер, который называется пептидогликаном. Это вещество состоит из параллельно чередующихся полисахаридных (гликановых) цепей, поперечно скрепленных пептидными связями. Пептидогликан придает клеточной стенке бактерий большую прочность и защищает их от действия осмотического давления, которое может достигать внутри клетки 20–25 атм.

При действии лизоцима, пенициллина и некоторых других веществ, разрушающих пептидогликан или нарушающих его синтез, бактерии вначале превращаются в сферопласты, а далее, полностью утратив клеточную стенку, – в бесформенные протопласты, быстро подвергающиеся плазмолизу. Дефектные по клеточной стенке бактерии, которые образуются в организме, обладают жизнеспособностью и патогенностью, называют L–формами в честь института Листера, где они были открыты.

Количественное содержание пептидогликана определяет характер окраски бактерий и других прокариот по Граму. Те из них, которые содержат в клеточной стенке большое его количество (около 90 % пептидогликана), окрашиваются по Граму в сине–фиолетовый цвет и их называют грамположительными, все другие, содержащие в оболочке 5–20 % пептидогликана, – в розовый цвет и их называют грамотрицательными. Толщина слоя пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий в несколько раз больше, чем у грамотрицательных.

Помимо пептидогликана, в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся тейхоевые кислоты, полисахариды и белки. Грамотрицательные бактерии покрыты наружной мембраной, в состав которой входят липополисахариды и базальные белки.

Окраска по Граму легла в основу классификации прокариот на 4 подраздела (см. с. 8). При этом тонкостенные бактерии раздела Gracilicutes, лишенные клеточной стенки протопласты и дефектные по клеточной стенке сферопласты, окрашиваются грамотрицательно, а толстостенные виды раздела Firmicutes – грамположительно.

Для окраски по Граму необходимо подготовить: 1) феноловый раствор генцианового фиолетового (генцианвиолет – 1 г, этанол 96 % – 10 мл, фенол кристаллический – 2 г, вода дистиллированная – 100 мл); 2) раствор Люголя – концентрированный раствор калия иодида (2 г), в котором растворяют кристаллический йод (1 г), а затем прибавляют дистиллированную воду (300 мл); 3) этанол 96 %; 4) водный фуксин Пфейффера.

Техника окраски по Граму. 1. Фиксированный мазок 1–2 мин окрашивают раствором генцианвиолета (по методу Синева его покрывают пропитанной тем же красителем полоской фильтровальной бумаги, которую смачивают 2–3 каплями воды). 2. Слив генцианвиолет (сняв полоску бумаги Синева), мазок 1 мин обрабатывают раствором Люголя и, не промывая водой, сливают его. 3. Обесцвечивают спиртом в течение 0,5 мин, промывают водой. 4. Окрашивают 1–2 мин фуксином Пфейффера. 5. Мазок ополаскивают водой и высушивают.

Для выявления грамположительных кислото– и спиртоустойчивых микобактерий туберкулеза и лепры, которые из–за большого количества в клеточных оболочках жировосковых веществ, миколовой кислоты и других оксикислот непроницаемы для разведенных растворов красителей, используют окраску по методу Циля – Нельсена. Окрашивание их по этому способу достигается при помощи концентрированного фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки микобактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и этилового спирта.

Техника окраски. 1. Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наносят фуксин Циля, и несколько раз подогревают над пламенем горелки до появления паров, подливая краситель, далее бумагу снимают и промывают водой. 2. Препарат обрабатывают (обесцвечивают) 5 % раствором серной кислоты и промывают водой. 3. На мазок наливают водно–спиртовой раствор метиленового синего, спустя 3–5 мин промывают водой и высушивают. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, – в светло–синий.

При необходимости дифференциации возбудителей лепры от микобактерии туберкулеза используют окраску мазков по методу Семеновича–Марциновского: 1) фиксированный препарат окрашивают в течение 2 мин разведенным 1:3 феноловым фуксином Циля и промывают водой; 2) в течение 3–5 мин обрабатывают щелочным раствором метиленового синего, промывают, высушивают и микроскопируют. Микобактерии лепры окрашиваются в красный цвет, а микобактерии туберкулеза остаются неокрашенными.

Капсула. Это ослизненный слой клеточной стенки, состоящий из полисахаридов (стрептококк пневмонии) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Способность к образованию микрокапсулы имеется у большинства бактерий, но четко выраженную макрокапсулу формируют только пневмококк, клебсиеллы пневмонии, озены, риносклеромы и возбудитель сибирской язвы. В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от фагоцитоза и сывороточных микробоцидных веществ. На искусственных питательных средах капсула обычно утрачивается, исключение составляет группа клебсиелл.

Для обнаружения капсул бактерий, плохо воспринимающих красители, используют специальные методы окраски – Бурри–Гинса и Книги.

Рис. 5. Капсулы бактерий

Обнаружение капсул по Бурри–Гинсу: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу; мазок высушивают, фиксируют (наносят 2–3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3–5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают; на темное фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий (рис. 5).

Окраска капсул по методу Книги: на обезжиренное предметное стекло нанося» каплю неразведенной нативной сыворотки, к ней добавляют каплю суточной бульонной культуры бактерий и тщательно перемешивают; ребром шлифованного предметного стекла делают тонкий мазок, а после высушивания его в течение 5 мин фиксируют метиловым спиртом; окрашивают 1 мин 1 % феноловым раствором генцианового фиолетового, разведенным 1:10, и промывают водой. По сравнению с интенсивно окрашенными в фиолетовый цвет бактериями капсулы–ореолы вокруг них имеют едва видимый фиолетовый оттенок.

Рис 6. Жгутики бактерий:

а – монотрихи; б – лофотрихи;

в – амфитрихи; г – перитрихи

Жгутики. Это органы движения бактерий. Они представляют собой вращающиеся полужесткие спирально изогнутые нити из белка флагеллина, который обладает способностью сокращаться. Длина жгутиков, как правило, больше самих бактерий и колеблется от 5 до 10 мкм в длину. Увидеть их в оптическом микроскопе невозможно, потому что поперечник жгутиков составляет не более 10–30 нм. Отходят жгутики от базальных телец, вмонтированных в цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерий.

По типу расположения и числу жгутиков бактерии делят на четыре группы (рис. 6): 1) монотрихи – имеют один жгутик на полюсе клетки; 2) лофотрихи – с пучком жгутиков на одном из концов палочки; 3) амфитрихи – с двумя пучками жгутиков на полюсах; 4) перитрихи – с множеством жгутиков вокруг бактерии. Жгутикование характерно, например, для кишечных бактерий, столбняка и ботулизма (перитрихи), холерного вибриона (монотрих), возбудителей содоку – болезни крысиного укуса (амфитрихи), щелочеобразователя (лофотрихи).

Под иммерсионным микроскопом жгутики можно увидеть лишь после специальных методов их протравливания и импрегнации солями серебра или ртути; пучки их на полюсах у живых бактерий – мультитрихов сравнительно легко обнаруживаются в фазово–контрастном микроскопе.

Рис. 7. Раздавленная и висячая капли

О наличии жгутиков чаще всего судят по направленному характеру движения бактерий в раздавленной и висячей каплях при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа. Для этого: 1) на середину предметного стекла наносят каплю суточной бульонной культуры бактерий и осторожно накрывают ее покровным стеклом так, чтобы жидкость не растекалась за его края и в нее не попадали пузырьки воздуха (раздавленная капля), или 2) ту же каплю бактерий наносят на середину покровного стекла и накладывают на него специальное предметное стекло с лункой, смазанной вокруг вазелином так, чтобы капля находилась в центре углубления. Препарат осторожно переворачивают и капля свисает (висячая капля) в герметически закрытой полости (рис. 7).

Раздавленную и висячую капли микроскопируют, слегка затемняя поле зрения посредством опускания конденсора, регулируя поступление света вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением (объектив х8), после того как обнаружат край капли, устанавливают объектив х40 или иммерсионный. Более наглядные результаты получают при микроскопии в темном поле зрения или в фазовом контрасте.

Ворсинки (реснички, пили). Это субмикроскопические нитевидные образования белковой природы длиной 0,3–1 мкм и шириной 10 нм, покрывающие тело некоторых энтеробактерий. Они полифункциональны: обусловливают трансмиссивную передачу генов (конъюгацию), являются рецепторами для бактериальных РНК–вирусов (фагов), органом прикрепления бактерий к питательному субстрату.

Эндоспора. Особая форма существования или стадия развития отдельных видов бактерий в неблагоприятных условиях. У патогенных бактерий спорообразование происходит вне организма, например в конце развития культуры на искусственных питательных средах, когда в них накапливаются вредные продукты метаболизма, или же в окружающей среде, куда они попадают с выделениями человека и животных.

Формирование эндоспоры начинается с деления нуклеоида, уплотнения и обособления определенного участка цитоплазмы вегетативной клетки, а заканчивается образованием внутри бактерии круглого или овального тельца, покрытого плотной многослойной оболочкой, пропитанной большим количеством липидов, кальция, дипиколиновой кислоты. После полного созревания споры материнская бактерия лизируется, но если сохраняется, то внутри нее спора четко контурируется, напоминая блестящее зерно. Среди патогенных бактерий споры формируют только крупные палочки. По отношению к их длине у разных видов бактерий споры располагаются в центре, субтерминально или терминально. При этом если размер споры не превышает поперечника палочки, то последняя имеет правильную цилиндрическую форму и называется бациллой, а если она больше, то бактерии вздуваются и становятся веретенообразными –клостридиями. Патогенной бациллой является возбудитель сибирской язвы. Спора у нее круглая, находится в центре палочки. Клостридии анаэробной инфекции имеют типичную форму веретена, клостридии ботулизма с эллипсоидной спорой напоминают теннисные ракетки, а клостридии столбняка с круглой спорой – барабанную палочку (рис. 8).

Эндоспоры бактерий выдерживают длительное кипячение, действие горячего воздуха (140–150°С) и химических дезинфицирующих веществ, многие годы сохраняются в почве, на растительности и предметах. Попадая в организм человека и животных, споры патогенных бактерий прорастают в материнские клетки за несколько часов.

Рис. 8. Споры бактерий:

а – бациллы; б – клостридии анаэробной инфекции; в – ботулизма; г – столбняка

Водным фуксином, водно–спиртовым метиленовым синим и по Граму эндоспоры не окрашиваются, так как их плотная многослойная оболочка непроницаема для обычных красителей. В мазках из патологических материалов, культур бацилл и клостридии, окрашенных простыми красителями, споры выглядят в виде бесцветных телец внутри окрашенных в соответствующий цвет вегетативных клеток или вне их. Окрашивать их можно по методу Циля–Нельсена, используя для обесцвечивания мазков после обработки их фуксином Пиля не 5 %, а 1 % серную кислоту. При этом эндоспоры, так же как микобактерии туберкулеза, красятся в розовый цвет и будут хорошо видны на синем фоне бактерий. Чаще для окрашивания спор используют специальные методы по Пешкову или Шефферу–Фультону.

Способ Пешкова. На фиксированный мазок наливают метиленовый синий по Леффлеру. Препарат нагревают в средней части пламени, кипятят 15–20 с, не допуская высыхания. Остывший препарат промывают водой, докрашивают в течение 30 с 0,5 % раствором нейтрального красного, затем снова промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в голубовато–синий цвет, тело бацилл и клостридии – в розовый.

Окраска спор по Шефферу–Фультону. Фиксированный мазок окрашивают 5 % водным раствором малахитового зеленого, 3–4 раза нагревая его до появления паров, промывают водой и докрашивают 0,5 % водным раствором сафранина. Споры окрашиваются в зеленый цвет, тело бактерий – в красный.

Морфологические и тинкториальные свойства бактерий. Описание бактерий проводится по определенной схеме. Прежде всего отмечают форму, размер и характер их расположения в мазке, а затем основные структурные особенности вида – жгутикование, образование капсул и спор, наличие включений и наконец тинкториальные свойства, или способность окрашиваться.

По внешнему виду различают шаровидные, палочковидные, извитые и нитевидные формы бактерий, а по тинкториальным свойствам –грамположительные и грамотрицательные.

Шаровидные бактерии называются кокками (греч. kokkos – зерно). Средний диаметр патогенных кокков около 1 мкм. В зависимости от их расположения в мазке, что определяется характером деления клеток, патогенные кокки подразделяют на диплококки (греч. diploos – двойной), стрептококки (греч. streptos – витой, цепочечный) и стафилококки (греч. staphyle – виноградная кисть). Диплококки и стрептококки делятся в одной плоскости, но остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. Стафилококки делятся в двух плоскостях и образуют скопления клеток, напоминающие грозди (рис. 9).

Рис. 9. Шаровидные бактерии

а – стафилококки,

б –стрептококки;

в – гонококки и менингококки

Рис. 10 Палочковидные бактерии

а – прямые с закруглёнными; б – с обрубленными концами; в – изогнутые; г – нитевидные

Непатогенные кокки располагаются беспорядочно (микрококки), тетрадами и пакетами по 8–16 особей (сарцины). При этом тетракокки и сарцины делятся в двух–трех плоскостях.

Патогенные кокки могут быть круглыми (стафилококки), овальными (стрептококки), бобовидными (диплококки). Непатогенные тетракокки, сарцины и микрококки имеют округлую форму.

Спор и жгутиков патогенные кокки не образуют. Капсулы имеют только некоторые стрептококки, в частности пневмококк. Стафилококки и стрептококки – грамположительные, а диплококки – грамотрицательные.

Палочковидные бактерии тоже весьма разнообразны по форме (рис. 10). Среди них встречаются прямые, изогнутые и даже ветвистые формы (микобактерии туберкулеза). Большинство патогенных палочковидных бактерий имеют овоидную форму. Исключение составляют цилиндрические бациллы сибирской язвы, веретенообразные клостридии, булавовидные коринебактерии (греч. coryne – булава), игольчатые и зернистые микобактерии туберкулеза.

Длина наименьших коккобактерий колеблется от 0,2 до 1,5 мкм, а самых больших – бацилл и клостридии – от 5 до 10 мкм.

Обычно палочковидные бактерии имеют однообразное гомогенное строение, однако встречаются зернистые варианты (микобактерии).

Располагаются палочки, как правило, беспорядочно, попарно в длину (капсульные клебсиеллы), параллельно (микобактерии), под углом, образуя фигуры в виде Х или V (коринебактерии дифтерии), а некоторые – цепями (возбудители сибирской язвы).

Многие виды патогенных палочковидных бактерий имеют жгутики и капсулы. Споры образуют бациллы и клостридии. Коккобактерий, истинные палочки, длиной 1,5–3 мкм и шириной 0,3–0,4 мкм, окрашиваются грамотрицательно. Бациллы, клостридии, коринебактерии, микобактерии, размеры которых больше средних палочек, грамположительны.

Извитыми бактериями являются спириллы, вибрионы и спирохеты.