31.Физическая иммобилизация ферментов

Представляет собоюй включение фермента в такую среду,в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема.При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями.Существует 4 типа связывания ферментов:адсорбция на нерастворимых носителях ;включение в поры геля; пространственное отделение от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки(мембраны);включение в двухфазную среду,где фермент растворим и может находится только в одной из фаз.Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов,начало ей было положено еще в 1916 г.Этот способ достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию.Удерживание адсорбционной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических вандерваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка.Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных группна поверхности молекулы фермента.Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов,выступающих в роли носителей.При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента,так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое.Использование зависимости реакции от рН раствора маскированные реагенты и реакции вытеснения можно довольно легко проводить селективные определения.К недостаткам аддсорбционной иммобилизацииотносят:отсуствие общих рекомендаций,позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизацииконкретного фермента.Их можно избежать при иммобилизации ферментов путем включения в гели Суть метода иммобилизации:молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей,образующих гель.Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа.При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера,а затем проводят полимеризацию,в результате чего образуется полимерный гель с включенным и в него молекулами фермента.В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи)сшивающие агенты ,которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки.В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера,который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние.Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гельпозволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации,обеспечивая при этом равномерное распределение с использованием мембран заключается в том,что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой.Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата,но непреодолима для крупных молекул фермента.При иммобилизации ферментов с использованием систем двухфазного типа ограничения свободы перемещения фермента системы достигается благодаря его способности растворяться в одной из фаз.Субстрат и продукт ферментного превращения распределяются между двумя фазами в соотвецтвии с их растворимостями в этих фазах.

32.Ковалентное прищепление модификатора на бумаге,кремнеземы и силикагели.При иммобилизации за счет ковалентного связывания (химическая иммобилизация)в качестве носителей используют бумагу,органополимерные сорбенты и силикагели.Число используемых носителей меньше по сравнению с числом носителей при физической иммобилизации.Способ получения кислотно-основных бумаг с ковалентным закреплением индикатора на бумагу описан очень давно.Аминосоединение с активной винилсульфоновой группой диазотировали и сочетали с различными азосоставляющими (1-нафтолом,фенолом,диметиланилином).При этом образовывались активные индикаторы.Индикаторные бумаги с ковалентно закрепленным реагентом получали обработкой целлюлозы в щелочной среде.Описан аналогичный синтез и ковалентное закрепление азокрасителейна бумаге для определения рН.Технически легче выполним способ получения индикаторных бумаг с химическисвязанными реагентами,который основан на использовании в качестве носителя хроматографической бумаги,модифицированной глицидилметакрилом и эпихлоргидрином.Ковалентное закрепление реагентов,в отличие от адсорбционного,приводит к тому,что такие бумаги использовались многократно,если образовавшийся при анализах комплекс разрушить,например промывкой водой или кислотой.Но многостадийность сложность синтеза,токсичность применяемыхреактивов,малая их доступность ограничивают применение таких систем.Много реактивных индикаторных бумаг(РИБ)с химической имммобилизацией реагентов было получено за последнее время.Большинство реагентов не расшифровано и названо мультидентатными.Предложенные автором устройства позволяют концентрировать в потоке и затем оценивать полуколичественно содержание исследуемых компонентов.Предложена РИБ на анионы SO₄,CI^-,CrO₄,окислители (CI₂ ), ароматические амины ,гидразин,кетоны(ацетон,метилбутилкетон,ацетоуксусная кислота),фенолы.На все РИБ приведены селективность на тестируемое соединение,пути практического использования,сроки хранения.Пределы обнаружения сопоставлены с ПДК этих соединений.Некоторые РИБ очень избирательны.Например,определению1 мг/л железа (ІІІ) при рН=3-4 с помощью РИБ-железо ( ІІ,ІІІ)-теста не мешают (в мг/л ): Cd,K,Ca,Mg,Na,Ni,Cr(ІІІ) ,Zn-1000; Mn(ІІ)-500; AI,Ba,B,Ga,Y,Co,Sn(II),TI,Th,W,Ag,Sr,Cr(VI),Ce-100; Sn(IV),Zr-30;Pd-20;Hg(II)-5;Be-4;V,Cu-3;NO₃,S₂O₈,SO₄,SO₃,S₂O₃,SO₃,S₂O₃,CI-1000;CH3COO^-,Cr₂O₇,BrO₃,MoO₄

33.Способы регистрации аналитического сигнала Любой метод аналитической химии основан на получении сигнала при воздействии на вещество.Сигнал ,дающий информацию о химическом составе вещества ,называется аналитическим сигналом.Следовательно,любая качественная реакция- аналитический сигнал-и образование окрашивания раствора ,и выпадения осадка,и окрашивание пламени –все это аналитические сигналы.Способов регистрации аналитических сигналов великое множество .По способу регистрации аналитического сигнала тет-методы делятся на инструментальные и визуальные(колористические,линейно –колористические,титриметрические).Тест-методики в зависимости от нужного аналитического сигнала очень сильно отличаются.К инструментальным тест методам относятся методы получения аналитического сигнала,при котором он будет четко фиксироваться прибором,который ,в свою очередь,допускает гараздо меньше ошибок,в случае,если бы проводилось получение аналитического сигнала с помощью органов чувств человека(к примеру зрения) Его несомненный плюс состоит в том что регистрация проходит четко и точно,но довольно большим минусом то,что такую тест методику чаще всегоневозможно проводить в <кустарных условиях>,тоесть вне лаборатории.К визуальным методам относятся:колористические,линейно-колоритические,титриметрические тест-методы.Все они основаны на регистрации сигнала с помощью глаза.Несомненный плюс этого типа методики в компактности ,и возможности проводить исследования данного типа вне лаборатории.Естественный минус его заключается в том что страдает точность регистрации аналитического сигнала,так как нет четкого стандарта по определениям человеческим глазом начала уровня окраски (к примеру в титриметрии) ,так и на яркость и насыщенность цвета.Поскольку у каждого человека свой тип зрения,в дополнение к тому ,что далеко не у всехоно стопроцентное,то точность этого типа тест-методов довольно сильно проигрывает по сравнению с инструментальными методами

34. Получение РИБ.Впитывающие бумаги,к-рые содержат закрепленные на них так называемые хромогенне реагенты , изменяют цвет при взаимодействии с определенными в-вами . РИБ получают пропиткой бумаги хромогенними реагентами обачно в смеси с вспомогательными веществами-компонентами буферних растворов, маскирующими, эмульгирующими, закрепляющими соединениями, катализаторами и т.д. Все эти в-ва адсорбирбируются бума гой. Другой способ получения РИБ- иммобилзация на целлюлозной основе хромогенних реагентов. При этом на модифицир. целлюлозной основе ( бумага , картон, гранулы) можно осуществлять многостадийный матричный синтез хромогенного реагента. Избыточные реактивы и побочные продукты удаляют промывкой целюлозного материала, из котрого изготовляют листы на бумагоделательной машине. Такие РИБ или КОИБ (если хромогенный реагент – кислотно- основной индикатор), можно длительно хранить и приманять многократно .Их выпускают в виде лент, листов и полосок, а также в виде полимерных полос, на которых имеются зоны из бумаги и других сорбентов для отделения мешающих веществ, обеспечение нужной последовательности реакций . После взаимодействия с определяемыми веществами на РИБ появляються окрашенные реактивне зоны. Для проведения качеств и количеств анализа окраску зон сравнивают визуально со стандартними цветовыми шкалами или измеряют коэфициентом отражения зон с помощью детектора с дисплеем , работающим по принципу отражателя фотомера со светодиотод (чувствительными элементами,реагирующим цветовые изменения).

В последнем случае необходимо строить градуировочную функцию. Анализ, основаный на изменении коифициента отражения , наиболее эффективен в случае использовинии РИБ и КОИБ , которые не загрязняют исследуемые растворы и окно светодиода. Часто применяют метод диахромного концентрирования ,которые заключается в следующем. РИБ закрепляю в специальные устройства ( желобе или трубке) и пропускают через нее ( например отсасывая шприцом) определенную пропорицию (3-10 мл) исследуемого раствора. При этом происходит изменение цвета реакционной зоны и одновремено концентрироание (накапление) определяемого компонента в ней. Используя этот прием можно по одним и тем же стандартным цветовы шкалам определять разные количества компонента, учитывая при расчетах объем пропущенного через РИБ раствора БИБ променяться для количества и качественного экспес-анализа природных и сточных вод, технология растворо минералов, гидкостей организма (в экспрс диагностике) при контроле коррозии и отмывки оборудования . Имеються также индикаторная бум ага для определения кишечной палочки, глюкотест для определения глюкозы в моче, индикаторные полосы для определния ацетона с пределом обнаружения 20 мг/100 мл , серебра в фиксажных рас творах,глюкозы в крови. Индикаторные експресс- тесты для определения нескольких компонентов при совместном присутствии например концентрации ионов водовода (pH) и ионов металла или диагностические экспресс-тесты для анали за 2-9 микрокомпонентов.