Лабор.діагност.вірус.хв

ЛЕКЦІЯ 11.

Тема лекції: РЕТРОВІРУСНІ ІНФЕКЦІЇТВАРИН

АНОТАЦІЯ. Викладено сучасні дані щодо біологі

ретровірусів	та	характеристики			ретровіруснихінфекцій
тварин. Акцентовано			увагу	на	етодах	лабораторної
діагностики останніх.

План лекції. 1. Біологія ретровірусів.

2.Лейкз великої рогатої худоби.

3.Інфекційна анемія коней.

ЗМІСТ ЛЕКЦІЇ
Ретровіруси				являють		собою		обширну			родину
Retroviridae.		Вони виділені			від	різноманітних				тварин і
людини. Назва родини пов'язана з ферментом– зворотною
транскриптазою (англ. revers transcriptase), який								входить			до
складу віріону.
Родина			ретровірусів			включає			три		: підродини
Оncovirinae, Spumavirinae, та Lentivirinae.
Підродина			Oncovirinae (від			лат. Oncos		-	пухлина)
включає		збудників		ряду	неопластичних				захворювань,
зокрема лейкозу великої рогатої худоби.
Підродина			Spumavirinae		(від	лат. spuma-			пінящий)
об'єднує ряд недостатньо вивчених ретровірусів, здатних
обумовлювати злиття клітин та утворювати синцитій. При
цьому	клітинна			культура	набуває		характер,			ногоаче

“спіненого”, вигляду. До				спумавірусів		належать збудники
синцитіальної інфекції великої рогатої худоби, кішок, мавп.
	Підродина Lentivirinae (від лат. lentiповільно) включає
ряд	збудників		повільних		вірусних		інфекцій, зокрема
інфекційної		анемії	коней, вісна-маеді				овець. Сюди	ж
відноситься		також	вірус	набутого		імунодефіциту		людини

(ВІЛ).

МОРФОЛОГІЯ І ХІМІЧНИЙ СКЛАД

Віріони ретровірусів сферичної форми, розміром 90 – 120 нм, мають суперкапсиду ліпопротеїнової природи з шипоподібними пепломерами. Капсид побудований за типом кубічної симетрії. Ретровіруси містять до 2% РНК, біля 65% білку , 30% ліпідів та 2% вуглеводів.

Характерною структурною особливістю у віріонів ретровірусів є унікальна серцевина. Остання представлена

власною капсулою ( внутрішня	білкова	мембрана) та
нуклеотидом, до складу якого	входить	РНК і .білокЗа

будовою серцевини онковіруси поділяються на три типи: С, В та D. Віріони типу С (діаметр біля 100 нм.) мають крупну (74-80 нм.) , розташовану центрально, серцевину. У віріонів типу В і D серцевини розташовані ексцентрично. У перших вона округлої а у останніх циліндричної форми.

Геном ретровірусів, на відміну від всіх останніх представників царства вірусів, диплоїдний – представлений двома однаковими молекулами РНК, молекулярною масою біля 3 МД. Він містить чотири гени : (5'→3') gay, pol, env, src.

	Ген gay ( від англ. group specific antigens -
групоспецифічні			антигени )	містять	близько 2500
нуклеотидів. У вірусу саркоми Рауса він кодує білок76 кД -
попередник		чотирьох	внутрішніх	білків віріону. Ген pol (
від	англ.	polimeraseполімераза) містить			біля 3000

нуклеотидів і кодує фермент зворотню транскриптазу.
	Ген env ( від англ. envelope - оболонка) містить біля
2200	нуклеотидів		та кодує	поліпептид			з молекулярною
масою 90кД, який є попередником					глікопротеїнів( gр85 та
gр37).
	Ген	src, або	онкоген (1600-2000			нуклеотидів)		кодує
білок		молекулярною		масою60		кД.	Останній
характеризується			протеїнкіназною		активністю			і відіграє
ключову роль в індукції неопластичної трансформації клітин.
Він	є	лише	у	онковірусів			що	характеризуютьс
трансформуючим			впливом	на	клітини. На		репродукцію

вірусу він не впливає. Втрата всіх інших генів обумовлює дефектність вірусу.

Онкогени у різних онковірусів різні. Нині відомо – 15 різноманітних онкогенів. Для всіх їх виявлені аналогічні послідовності у ДНК нормальних клітин господарів, що

стверджує

раніше

запропоновану

гіпотезу

клітинного

походження вірусних онкогенів

Білки. У складі ретровірусів виявляється від11 до 13

структурних

білків.

Найменше

білків

локалізовано

у

серцевині. Головний внутрішній білок Р27-Р30 розташований

у мембрані, що оточує РНК. Два - п'ять білків гліколізовані і

знаходяться

у складі ліпопротеїнової оболонки. З ними

пов'язана

типоспецифічна

характеристика .

вірусів

Групоспецифічні антигени знаходяться у серцевині вірусу.

Основним групоспецифічним антигеном являється головний

внутрішній білок Р27-Р30.

У

віріонах

онковірусів

виявлено

ряд

білків

з

ферментативною активністю, зокрема РНКзалежна ДНК-

полімераза,

ДНКзалежна

ДНК -полімераза,

нуклеази,

протеїнкінази і інші.

Зворотна

транскриптаза (РНК-

залежна

ДНК –

полімераза) зв'язана з нуклеоїдом віріонів і представлена у

онковірусів 10-20 молекулами на віріон. Молекулярна маса

цього ферменту у віріонах типу С становить 70 кД, у В та D -

100-105кД. У онковірусів птахів ідентифіковано дві форми

зворотної транскриптази : L (65кД) та

В (105кД). У

віріоні

вони утворюють комплекс LB.

РЕПРОДУКЦІЯ

І

КУЛЬТИВУВАННЯ

В

процесі

репродукції

онковірусів

синтезується.

Д

Вірусоспецифічна ДНК утворюється через стадію утворення

гібридної двохнитчастої молекули РНК-ДНК. Пізніше РНК

руйнується

ферментом,

а

на

ДНК

синтезується

комплементарна їй нитка ДНК. Таким чином утворюється дволанцюгова молекула ДНК, яка інтегрує з клітинним геномом і вірусоспецифічним транскрибується з утворенням вірусної РНК, котра виконує – роль іРНК і забезпечує синтез вірусоспецифічних білків , а потім, з'єднуючись з останніми, приймає участь у формуванні віріонів. В процесі дозрівання вірусні білки модифікуються, частина з них гліколізується. Вихід віріонів здійснюється шляхом брунькування через зовнішню клітинну мембрану.

Онковіруси культивуються на тваринах і у клітинних культурах. У останніх вони обумовлюють хронічну інфекцію і можуть накопичуватись в культуральній рідині у досить високих концентраціях (10↑8,5-10↑7,5 віріонів в 1см3).

ЛЕЙКОЗ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

Лейкоз великої рогатої худоби– хронічна інфекційна

хвороба

пухлинної

природи. Основною

її

ознакою

є

розростання клітин кровотворних органів з порушенням їх

дозрівання,

в

результаті

чого

відбувається

дифузна

інфільтрація органів цими клітинами, або ж утворюються

пухлини. Хвороба реєструється повсюди.

Вірус відкритий у 1974 році (Ferrer,1974). Належить до

підродини

онковірусів.

Віріони

вірусу

лейкозу

містять

поліпептиди р10,

р12, р15, р24, р30

та р 64 кд;

а

також

глікопротеїди (gр30 і gр51). Вірус

характеризується

виразною

антигенною

активністю. Імунопротективним

компонентом його вважається глікопротеїдgр51. В ньому

виявлено три епітопи , відповідальні за нейтралізацію вірусу.

Полі-

та

моноклональні

антитіла

gпроти51

характеризуються

віруснейтралізуючою

активністю,

подавляють

синцитій-утворюючу

активність

,

вірусу

заважають його виходу з клітин і

обумовлюють

лізис

інфікованих клітин в присутності комплементу.

Вірус має антигенну спорідненість з збудником- Т

клітинного лейкозу людини. Він у антигенному відношенні

відрізняється від відомих вірусів лейкозу мишей і кішок.

КУЛЬТИВУВАННЯ

Вірус

лейкозу

великої

рогатої

худоби репродукується в культурах лейкоцитів інфікованих

тварин, а також у перещеплюваних клітинних культурах.

Характерною особливістю є тривала репродукція вірусу при

збереженні

життєздатності

інфікованих .

клітин

Репродукований

вірус

виділяється

в

екстрацеллюлярний

простір,

звідки

його

можна

отримати

у

препаративній

кількості.

Найбільш

широкого

розповсюдження, як

“продуцент вірусу” набула у світі перещеплювана клітинна

культура FLK-BLV, отримана

ще

у1974

році

шляхом

співкультивування ембріональних клітин нирки вівці з

лімфоцитами хворої на лейкоз тварини. (Van der

Maaten,

1974) Пізніше були запропоновані ще ряд культурFLK-BLV

клітинна культура з тимусу великої рогатої худоби і легень

летючих

мишей,

а також з тканин

людини, мавпи,

коня,

кішки, собаки.

Інтенсивність репродукції вірусу залежить від ряду обставин. Так за допомогою фіто-мітогенів(ФА і КонА) вдавалось підвищувати титр вірусу в клітинних культурах,

отриманих з крові інфікованих тварин. Встановлено, що 5-
йоддезоксиуридин			і 5-бромдезоксиуридин					та	мітоцин С
стимулюють продукцію вірусу у спонтанно інфікованих
клітинних культурах.
Реплікація			вірусу		лейкозу		не		супроводжується
руйнуванням		моношару			клітин. Проте			спостерігається
утворення синцитію.
При дотриманні оптимальних умов культивування,
хронічно	інфіковані			клітинні		лінії(FLK, ФЕК-МРА-76)
здатні забезпечити репродукцію вірусу протягом тривалого
часу (понад 200 пасажів).
ГЕМАГЛЮТИНУЮЧІ ВЛАСТИВОСТІ. Вірус лейкозу
великої рогатої худоби аглютинує лише еритроцити крові
мишей. Найбільш				інтенсивне		склеювання			еритроцитів
відбувається при			рН6	і температурі 4˚С. Гемаглютинація
пов'язана з gр51. Після обробки вірусної суспензії тритоном
Х100, або ультразвуком, гемаглютинуюча активність зростає
у 6-16 разів.
СТІЙКІСТЬ.			Вірус		термолабільний - при 56˚С
руйнується	протягом 15-ти хвилин, при 74˚С. за 16 секунд,
чутливий	до		ефіру		і	хлороформу, руйнується				при
заморожуванні – відтаванні.
ПАТОГЕННІСТЬ. У природних умовах патогенні для
великої рогатої худоби. В експериментальних - захворюють
телята, вівці. Інфекцію, проте без клінічного прояву, можна
відтворити	також		у кіз, свиней,			кролів. Білі		миші, щури,
хом'яки, морські свинки не чутливі.
У природних умовах зараження чутливих тварин може
відбуватись пренатально та частіше постнатально. Механізм
пренатального		зараження			може являти			собою		передачу
вірусного геному через гамети(генетична чи хромосомна
трансляція ) або передачу сформованого вірусу (епігенетична
екстрахромосомна трансляція).
Постнатальна передача здійснюється через молоко чи
під час прямого контакту. У останньому випадку вірус
заноситься	в		організм		з	різноманітними				секретами	і
екскретами	або		комахами		чи	контамінованими				об'єктами
(ін'єкційними голками, хірургічними інструментами тощо).
Доведено,	що	вірус		тривалий		час	персистує		в	організмі
кліщів і може передаватись через них великій рогатій худобі.
Контактна передача - основний шлях розповсюдження

лейкозу

в

природних

умовах. Допускається, що

вірус

передається переважно з інфікованими лейкоцитами. Так,

після

внутрішньошкірного

введення2500

заражених

лейкоцитів, корова захворіла.

Це потрібно мати на увазі , тимхто маніпулює в

неблагополучних по лейкозу стадах тварин.

Вірус

лейкозу

та

інфіковані

ним

лімфоцити

у

переважній більшості присутні в молоці інфікованих корів. У

фекаліях, сечі, спермі він не виявляється.

Інкубаційний період у великої рогатої худоби триває

при

експериментальному

зараженні60-750 діб, при

спонтанному

- від 2 до 6

років. Хвороба

розвивається

повільно.

Спочатку

з'являються

ознаки

імунобіологічної

перебудови, коли, за допомогою серологічних реакцій можна

зафіксувати

появу

антитіл, потім

виникають

зміни

клітинного

складу

крові, реєструються

лейкоцитоз

і

лімфоцитоз, погіршується загальний стан, падають надої

молока, тварини і гинуть.

Проте

у більшості

випадків

лейкоз

має

латентний

перебіг.

Захворюваність

коливається

від3

до

20%,

летальність сягає 15%.

У

експериментально

заражених

овець

інфекція

розвивається значно швидше. Після внутрішньочеревного,

підшкірного,

внутрішньошкірного та внутрішньом’язевого

введення лейкоцитів від хворих на лейкоз тварин, вже через

1519 діб можна виявити ознаки хвороби за допомогою

серологічних та вірусологічних методів.

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА

Діагноз

на

лейкоз

ставиться

на

основі

результатів

клініко-епізоотологічного

обстеження,

результатів

патологоанатомічного розтину та лабораторних досліджень.

Останні

включають

гематологічне, гістологічне

та

серологічне

дослідження

матеріалів. В

спеціалізованих

лабораторіях,

крім

того, можна здійснювати виділення та

ідентифікацію

збудника,

електронномікроскопічне

дослідження матеріалів.

Останнім часом широкого розповсюдження набула РІД

з лейкозними антигенами. Поряд з РІД застосовують також

ІФА. Проте найбільш чітку діагностику можна здійснити

лише за допомогою ПЛР, котра дозволяє виявити мінімальну

кількість

антигену

в

патологічних

матеріалах від хворих

тварин. В залежності від конкретної ситуації використання
вищеназваних методів бажано поєднувати.
Розроблені і інші методи лабораторної діагностики
лейкозу.	Радіоімунний аналіз,			реакція		аглютинації		латексу,
метод	люмінесцентного				дослідження			плазми ,	крові
цитогенетичний		(метафазний)		метод		тощо.	Проте	вони не
набули широкого розповсюдження.
ІМУНІТЕТ
У	природних			умовах			певне	значення		ма
колостральний		імунітет,	який		триває		кілька	місяців		і
залежить	від	ряду	обставин, зокрема				від	кількості
молозивних імуноглобулінів.

Удорослих інфікованих тварин, е дивлячись на

наявність	віруснейтралізуючих			антитіл	і	інших	факторів
захисту,	інфекційний		процес	не	зупиняється. Штучна
імунізація поки-що не набула широкого розповсюдження. Є
повідомлення		щодо		позитивних		результатів		при
використанні		інактивованих препаратів(Miller				I.M.	et аl,

1978) Двократне введення інактивованої 0,05%-ним АЕН, або 0,02% ДЕІ вакцини телятам обумовлено індукцію високих титрів віруснейтралізуючих антитіл та резистентність до

експериментального зараження.
Інші автори (Шишков В.П. і ін. 1979) стверджують, що
найбільш імуногенною може бути вакцина, виготовлена на
основі поверхневих глікопротеїдів (g51) та внутрішніх білків.
У дослідах на вівцях, щеплених трикратно глікопротеїдним
антигеном, було встановлено, що тварини з титром антитіл
до gр51 (в РІД) 1:64 (Kono Y. et al, 1986), не захворюють на
лейкоз.
В	Україні	розробкою	протилейкозних		вакцин
займається	ряд	вчених(Нагаєва..,	Завірюха	А.).І

Запропоновані ними препарати виявили протективну дію в експериментальних та обмежених виробничих дослідах.

ІНФЕКЦІЙНА АНЕМІЯ КОНЕЙ

Інфекційна анемія коней (ІНАН, болотяна лихоманка) – інфекційна хвороба однокопитних. Характеризується ураженням кровотворних органів, переважно хронічним перебігом, лихоманкою ремітуючого типу та анемією.

Хвороба реєструється в багатьох країнах світу, в тому числі і в Україні.

Збудник (Equine infectious anemia retrovirus)

належить до підродиниLentivirinae. В його структурі виявлено шість основних білків з молекулярною масою від9 до 90 кД (табл. ) і чотири мінорних поліпептиди.

Табл. 1. Основні структурні білки вірусу ІНАН коней (Сергєєв В.О., Орлянкін Б.Г.,1983).

	Назв	Кількі
	а та
	молекуляр	сть молекул	Локалізація
	на маса	у віріоні
	білка
	gр90	300	Оболонка
			віріону
	Gр4	300	-//-
	5
	Р26	6000	Серцевина
	Р15	7600	-//-
	Р11	2000	-//-
	Р9	3300	-//-

До складу зовнішнього шару оболонки віріонів входять
два глікопротеїди –			gр90 та	gр45.	Обидва глікопротеїди
характеризуються виразними імуногенними властивостями.
Збудник	ІНАН,	як	і	більшість		інших	ретровірусів,
характеризується		антигенною			лабільністю. Частота			їх
мутацій	у 100-1000 раз перевищує				аналогічний показник				у
інших РНК-вмістимих вірусів. У					вірусу	ІНАН	навіть		в
процесі інфекції у тварини, виявлені антигенно відмінні
варіанти. Виділені від хворої тварини з інтервалом у									два
тижні, ізоляти вірусу мали суттєві антигенні							відмінності.
Білки	серцевини		при	цьому	залишались		ідентичними.

Відмінними були лише поверхневі глікопротеїди( Hussian K.A.et al.,1987; Paune S.L. et al.,1987).

КУЛЬТИВУВАННЯ Вірус культивують в ряді клітинних культур та в

експлантатах тканин з селезінки, надниркових залоз та лімфовузлів лошат.

Укультурі лейкоцитів , конейпри зараженні

адаптованим до культури штамом вірусу, виявляються ознаки ЦПД. Зміни відбуваються повільно і переважно на 1012 добу інкубації. Титр адаптованого до клітинної культури

вірусу становить 106107 ТЦД 50/мл.

Для серійного пасажування вірусу ІНАН застосовують чисту культуру лейкоцитів віслюка.

Крім названих, окремі дослідники культивують збудник ІНАН в клітинній культурі з нирок коня( лінія V- 26), або ж у клітин ПАТ - ній культурі , отриманій з шкіряно- м'язових тканин коня.

ГЕМАГЛЮТИНУЮЧІ ВЛАСТИВОСТІ. Вірус склеює еритроцити крові морської свинки. Найбільш виразна гемаглютинуюча активність спостерігається при температурі

370С.

РЕЗИСТЕНТНІСТЬ. Вірус термолабільний. При 600С
втрачає вірулентність за 30 хв. Інактивується під дією
сонячних		променів		за1 –2 год. У			тваринницьких
приміщеннях		зберігає		життєздатність		на	протязі	кількох
місяців.	Стійкий		до	висушування		і	гниття. Відносно
резистентний до дезінфектантів: 2%-ний розчин гідроксиду
натрію	та 25-ний		розчин	формаліну інактивують його за5
хв., 25-ний розчин перманганату калію, 25-ний розчин вапна
вірус не знешкоджують.
ПАТОГЕННІСТЬ.				У	природних		умовах	вірус
патогенний		для	коней, ослів		і мулів. У	цих же тварин

вдається викликати інфекцію і у експериментальних умовах. Лошата захворюють після підшкірного, внутрішньовенного та зрідка перорального зараження. Віслюки та мули в

експериментальних			умовах	заражаються		.рідкоІнколи
вдається заразити також свиней.
ПАТОЕНЕЗ, КЛІНІКА ТА ПЕРЕБІГ ХВОРОБИ.
Заражаються			тварини,		головним	чином,
парантеральним шляхом. Важлива роль при цьому належить
комахам-кровососам. Вірус швидко розповсюджується по
організму. Вже		через 6 – 38 діб		після штучного		зараження
тварини	його	виявляють у		клітинах селезінки, печінки,
легень,	кісткового		мозку, головного		мозку та ін.	Особливо

інтенсивно вірус репродукується у клітинах кісткового мозку
і крові, обумовлюючи пригнічення еритропоезу та гемоліз
частини	еритроцитів. Розвивається анемія.					В результаті
ураження лімфоцитів різко погіршується клітинний імунітет.
Через	руйнування		клітин	накопичується		велика	кількість
білка	(тканинного		антигену),		що	призводить		до
автоалергізації		організму.		Не	дивлячись	на	наявність

специфічних антитіл, вірус тривалий час не інактивується, а циркулює в комплексах“антиген-антитіло”. Наявність останніх, в свою чергу, усугубляє інфекційний процес.

Інкубаційний період може тривати від4-5 діб до 3-х місяців, проте частіше 10-30 діб.

Перебіг хвороби може бути надгострим, гострим, хронічним, та латентним. При надгострому перебігу спостерігається пригнічення, висока температура, серцева слабкість, часте дихання, геморрагічний ентерит, параліч тазових кінцівок. Хвороба триває 1-2 доби і завершується загибеллю.

Гострий перебіг ІНАН характеризується раптовим

підвищенням		температури				тіла 40до-42ºС.		Інколи
спостерігаються кольки, пронос, набряки в ділянках грудей і
живота. Через 3-15 діб тварини гинуть або хвороба набуває
іншого, напівгострого			характеру.			При	цьому	вона	може
тривати 2-3 місяці. Періоди підйому та спаду температури
чергуються.
При латентній формі ознаки хвороби, за виключенням
епізодичних підйомів температури тіла, не реєструються.
Тварини	з	латентною			формою		інфекції	можуть		бути
вірусоносіями до 10-ти, а зрідка і до 18-ти років.
При розтині трупів тварин, що загинули, виявляється
геморрагічний		діатез,	збільшення			лімфовузлів, селезінки,
дряблість міокарду, жовтушність слизових оболонок.
ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА
Хворобу діагностують на основі аналізу результатів
клінічного,		епізоотологічного,				гематологічного			і
лабораторного дослідження, а також результатів патолого-
анатомічного розтину та гістологічного дослідження.
Лабораторна діагностика базується на використанні
серологічних методів (РДП,					РЗК,	РІФ, РЗГА).		А також
використовують ПЛР.			Інколи		ставлять		біологічну		пробу,
здійснюють гістологічне та гематологічне дослідження.
Біопробу ставлять на лошатах. З благополучного
господарства доставляють двох лошат віком6-12 місяців і
досліджують їх гематологічним та серологічним методами
чотирьохкратно		з	інтервалом7			діб.	При	відсутності
показників,	характерних			для		ІНАН, лошат		заражають

сироваткою крові або плазмою, отриманою від хворих коней. Попередньо матеріал контролюють на можливу бактеріальну