Лабор.діагност.вірус.хв

Коронавіруси – відносно великі РНК– місткі віруси,

мають ліпопротеїнову оболонку. Встановлена їх етіологічна

роль в захворюваннях людей та тварин. Спочатку перші

виділені коронавіруси були віднесені до ортоміксовірусів,

оскільки вони нагадували останніх по структурі і розмірам

частинок,

а

також

були

виділені

від

хворих

при

респіраторних

інфекціях. Однак

зараз

очевидно, що

коронавіруси представляють із себе окрему групу вірусів, що

по багатьом показникам відрізняються як від ортоміксо– так

і від параміксовірусів. Коронавіруси містять плюс– нитку

РНК і мають унікальний механізм реплікації. У них відсутня

нейрамінідазна

активність, і

вони

не

зв’язуються

з

рецепторами, що мають в своєму складі сіалову кислоту.

Основні властивості коронавірусів представлені в табл.2.

Родина коронавірусів (Соrоnaviridae) включає в себе

два роди: Сoronavirus та Torovirus.

Спочатку коронавіруси були виділені в окрему групу

на основі морфологічних відмінностей, що добре видно на

негативно контрастованих препаратах віріонів. Із оболонки

вірусних

частинок ,

що

мають

діаметр80

– 160 нм

виступають

великі,

чітко

видимі

під

електронним

мікроскопом глікопротеїнові виступи в вигляді булав–

пепломери. Довжина

пепломерів

коливається

від15

до 23

нм.. Свою назву коронавіруси отримали завдяки подібності

цих

виростів

зcorona

spinarum

–

вінцем

навколо

голови

святого на релігійних картинах. Деяким авторам ці виступи

нагадують сонячну корону. Протягом багатьох років вперше

відкриті віруси відносили до родини коронавірусів тільки по

їх

характерній

морфології, і

навіть

сьогодні

виділені

коронавіруси ідентифікують з використанням негативного

контрастування.

Характерною рисою коронавірусів є широкий спектр

їх природних господарів в поєднанні з вираженим видовим

обмеженням патогенності. За здатністю вражати різні органи

коронавіруси

можуть

бути

віднесеними

до

пантропних

вірусів. Захворювання,

що

викликають коронавіруси,

мають

восновному гострий перебіг, однак вони можуть переходити

вхронічні та латентні форми. Всім видам коронавірусів присуща чітка залежність між віком сприятливого організму та інтенсивністю прояви клінічного синдрому. Так, тяжкі

смертельні гастроентерити і енцефаломієліти відмічаються

тільки	у	поросят(	при		вірусному	інфекційному
гастроентериті		і	гемаглютинуючому			енцефаломієліті
свиней), діарея із летальним кінцем спостерігається лише у
новонароджених		телят (		при	коронавірусній		діареї
новонароджених		телят), тяжкі		бронхіти – тільки		у	курчат

(при інфекційному бронхіті курей). У дорослих тварин тих же видів інфекції протікають в стертій формі або ж латентно.

Структура віріонів. Вірусний геном представляє із себе одноланцюгову РНК (плюс - нитку). Як і в випадку інших

вірусів, що мають		плюс– нитку РНК, геномна РНК
коронавірусів інфекційна при введенні в клітини еукаріот.
Табл.2 Властивості коронавірусів.
		Круглий (овальний) віріон
		діаметром 80 – 160 нм.
Струк		Оболонка вірусу з великими,
		розміщеними далеко один
тура
		від одного пепломерами.
		Спіральний нуклеокапсид
		діаметром 10 – 20 нм.
Геномн		Плюс – нитка. Одна молекула:
		ММ 5500000.
а РНК
		Може служити як мРНК
		Пепломерний глікопротеїн S
Структ		(ММ 180000 – 200000).
		Матриксний глікопротеїн M
урні білки		(ММ23000 – 30000).
		Нуклеокапсидний фосфопротеїн
		N (ММ 50000 – 60000).
Місце		Мембрани ЕР та апарату
брунькування		Гольджі.
Біологі		Злиття клітин. Протеїнкіназа.
чна і
		Гемаглютинація (не всі
фермен
		коронавіруси
тативна
		викликають гемаглютинацію).
активні
сть віріонів

Молекули основного фосфопротеїнуN (ММ 50000 – 80000), взаємодіючи з геномною РНК, утворюють досить

довгий нуклеокапсид із спіральною симетрією. Товщина спіралі нуклеокапсиду складає9 – 11 нм. Нуклеокапсид знаходиться в ліпопротеїновій оболонці, що формується із ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) або апарату Гольджі заражених клітин. Структура коронавірусу представлена на рис. 2. Оболонка віріонів складається із ліпідного подвійного

шару, який	включає			в		себе	два	вірусних		глікопротеїниM
(стара назва		1)Е	та	S	(стара		назва 2)Е . Ці			глікопротеїни
виконують у вірусі важливі функції. Так,										пепломерний
глікопротеїн		S	виконує			такі		функції: -		зв’язується	з
рецепторами клітини – господаря (антирецептор); - викликає
злиття клітин; - може викликати злиття вірусної оболонки з
мембраною	клітини;			-	індукує		утворення			нейтралізуючих
антитіл.	Матриксний					глікопротеїн M				забезпечує
відбруньковування від мембран ЕР і										апарату	Гольджі;
утворює вірусну оболонку, а також взаємодіє з вірусним
нуклеокапсидом.
Глікопротеїн M (20000 – 30000) є									трансмембранним
білком, який в деякій мірі суттєвим чином відрізняється від
глікопротеїнів		інших			вірусів. Він занурений в оболонку
досить глибоко, так що на зовнішній поверхні ліпідного шару
знаходиться лише невелика гліколізована N – кінцева ділянка
білка. Така		локалізація				глікопротеїнуM			підтверджується

дослідами по синтезу M in vitro. Функції M, очевидно, такі ж
, як і в негліколізованих матриксних білків ортоміксо- ,
параміксо	–	і	рабдовірусів,	які		сприяють	включенню
нуклеокапсиду		в	оболонку	вірусу		при брунькуванні. На
відміну від інших вірусних глікопротеїнів M не переноситься
на плазматичну мембрану. Його накопичення проходить в
апараті Гольджі, і тому саме тут, а не на плазматичній
мембрані проходить процес брунькування коронавірусів.
Антитіла	до M		нейтралізують		інфекційність		вірусних
частинок тільки в присутності комплементу.
Інший глікопротеїн коронавірусів– S (ММ 180000 –
200000) –	нагадують глікопротеїни					великих	вірусів, що

мають	мінус – нитку		РНК: в	ліпідний		шар	занурена тільки
невелика частина молекули глікопротеїну, тоді як більша
частина молекули знаходиться ззовні. S гліколізується по
аспарагіновим		залишкам,		а	потім		переноситься	на
плазматичну мембрану заражених клітин. Він є структурним
білком	пепломерів		і тому		грає	роль	антирецептора, за

допомогою якого вірусна частинка прикріплюється до рецепторів на поверхні клітини. Антитіла до S нейтралізують інфекційність вірусу, а наявність S на плазматичній мембрані робить заражені коронавірусом клітини чутливими до цитотоксичних лімфоцитів. Як і в інших вірусів з плюс– ниткою РНК, в віріоні коронавірусів немає РНК– залежної РНК – полімерази.

ІНФЕКЦІЙНИЙ БРОНХІТ ПТАХІВ.
Інфекційний	бронхіт	птахів(ІБП) – гостре

висококонтагіозне захворювання курей всіх вікових груп. Викликає значне зниження яйценосності та великий відхід курчат.

В наш час захворювання зустрічається у всіх країнах, де птахівництво поставлено на промислову основу.

Вірус вперше виділили Біч і Шалк в США в 1936 р.

Показана антигенна і імуногенна варіабельність польових штамів вірусу ІБП. Чітко визначені 7 серологічних

типів цього вірусу: А (D207), В (D3896), C (D3128), D (D212),

Массачусетс (Mass), ІК11 та ІК12. В межах вказаних серотипів відомі наступні штами: Массачусетс – 41, Коннектикут А-5968, Айова – 97, Айова – 609, Грей Холт,

УМК Арміленд, Брісбеїн, КН, Ishida, Nerima і Shiga.

КУЛЬТИВУВАННЯ.

Вірус

в

лабораторних

умовах

вдається культивувати в курячих ембріонах при зараженні в

алантоїсну порожнину, амніон або на ХАО. Адаптація вірусу

до курячих ембріонів проходить паралельно із зростанням

відсотка і скороченням строків загибелі. Вірусомїх ІБП

заражають 9 – 10денні курячі ембріони. Адаптація вірусу

наступає

через 3 –

6 і більше

пасажів. Заражені

ембріони

гинуть через 3 – 6 днів в першому пасажі до 10%, а в п’ятому

- до 61% і в десятому до 83%. Однак загибель ембріонів – не

єдина ознака враження вірусом . ІБПДля цього вірусу

характерно уповільнення росту та розвитку ембріонів через 6

днів

після

зараження

і

збільшення

екстраембріональної

рідини. Інфіковані ембріони кулястої форми, муміфіковані,

значно

дрібніші,

ніж

такого

ж

віку

здорові. ”Ефект

карликовості”

має

велике

діагностичне

значення

при

виділенні польових ізолятів на курячих ембріонах. Крім того,

у

інфікованих

курячих

ембріонів

жовток

зморщений,

постійно знаходять ураження нирок. ХАО і амніотична

оболонки набряклі.

При введені вірусу в алантоїсну порожнину найвища
концентрація		його	знаходиться		через36 годин		після
зараження в		ХАО, потім в алантоїсній рідині, амніоні і
печінці ембріона. Якщо загиблі ембріони залишаються на
деякий	час	в	інкубаторі, титр		вірусу	знижується.
Максимальний вихід вірусу107,2ЕІД50/0,1мл виявляється
при дозі зараження103ЕІД50/0,1мл при культивуванні в
умовах	360С.	Більш	високі	дози	не збільшують		виходу
“врожаю” вірусу. Підбір				оптимальної		температури		і
тривалості культивування є важливим для підвищення титру
вірусу,	якщо	мати на увазі , тещо в алантоїсній рідині
мертвих ембріонів знаходять інтерферон. Різні штами вірусу
ІБП	можуть	при	зміні	температури		проявляти		різну
вірулентність для курячих ембріонів і органних культур, що
відображає вірулентність і тропізм цих штамів для курей.
Більшість штамів вірусу розмножуються в культурі
клітин нирки курячого ембріону, фібробластів курячого
ембріону і клітин ВНК - 21.
ГЕМАГЛЮТИНУЮЧІ				ВЛАСТИВОСТІ. Більшість
штамів вірусу ІБП не аглютинують еритроцити птахів, однак
при обробці цього вірусу фосфоліпазою С типу1 він легко
викликає гемаглютинацію. Фермент модифікує оболонку
вірусу за рахунок руйнування фосфоліпідів і викликає появу
на поверхні		віріону	протеїну гемаглютиніну. Крім				того,

гемаглютинаційні властивості вірусу ІБП проявляються після обробки його 0,5%- ним розчином трипсину (90 хвилин при 370С), який руйнує пептидні зв’язки аргініну і лізину

поверхневих молекул		вірусного білку		і звільняє	скриті
молекули гемаглютиніну.
	СТІЙКІСТЬ	ВІРУСУ.	Стійкість	вірусу	в
навколишньому середовищі слабка. В трупах птиці					він
швидко втрачає інфекційну активність. Більшість штамів
вірусу ІБП інактивується при 560С за 10 хвилин, однак серед
них	зустрічаються	варіанти, що		різняться	по

терморезистентності. Ця властивість залежить від числа пасажів вірусу на курячих ембріонах. Низька температура консервує вірус. Так, в інфікованій алантоїсній рідині при температурі мінус 300С вірус залишається активним протягом 17 років.

Всі штами відносно резистентні до кислого середовища з рН 3,0 , але до лужного середовища з рН11 вони чутливі.

Всі

штами

цього

вірусу

чутливі

до

хлороформу

і

дезоксихолату натрію.

ПАТОГЕННІСТЬ. Розрізняють три клінічні синдроми

захворювання: - респіраторний, - нефрозно –

нефрітний

та

репродуктивний.

Респіраторний

синдром

проявляється

у

молодняку

і

характеризується

кашлем, трахеальними

хрипами,

виділенням

із

носових

отворів, затрудненим

диханням і деяких випадках кон’юнктивітом, ринітом і

синусітом. Висока смертність відмічається головним чином

серед курчат до місячного віку, а у

молодняку2 – 3 –

місячного віку вона може досягати90%, але частіше всього

буває

в

межах10 – 35%. У

курчат 30 – 60денного

віку

захворювання протікає, як правило, хронічно та в асоціації з

колібактеріозом або мікоплазмозом. При розтині трупів

знаходять

серозний

катаральний

або

казеозний ексудат

в

трахеї і бронхах.

Нефрозно –

нефрітний

синдром. Деякі

штами

вірусу

мають нефрогенний тропізм і можуть протягом перших двох

тижнів захворювання вражати нирки і сечевідводящі шляхи з

відкладенням у них уратів. Перебіг захворювання гостре. У

хворих птахів відмічають депресію та діарею.

Репродуктивний

синдром. Ураження

репродуктивних

органів

відмічається

здебільшого

у курей старше6 –

місячного віку. Захворювання протікає безсимптомно або з

незначним

ураженням

органів

дихання. Проявленням

хвороби в цьому випадку є тривале в часі значне зниження

яйценосності від 30 до 80%, яке залежить від віку курей. В

подальшому яйценосність відновлюється, але не досягає

попереднього рівня. Хворі кури несуть дрібні, неправильної

форми яйця з тонкою шкарлупою.

У великих птахогосподарствах ІБП має стаціонарний

характер і перебігає як хронічна

інфекція

без

яскраво

виражених

симптомів

ураження

респіраторних

органів;

курчат в найбільш чутливому віці (1 – 30 днів) в значній мірі

захищає пасивний імунітет.

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА. Діагноз на ІБП

ставлять на основі епізоотологічних даних, клінічних ознак

захворювання, патологоанатомічних змін

і

лабораторних

досліджень (виділення та ідентифікація вірусу і знаходження

специфічних антитіл у перехворівших птахів).

Виділення

вірусу.

Для

дослідження

від

хворої

птиці

відбирають змиви з трахеї, гортані під час інкубаційного

періоду або при проявленні яскравих клінічних ознак. Від

вимушено

забитих

або

птахів, що

тільки

загинули

відбирають

шматочки

легенів, нирок,

трахеї,

гортані,

бронхів; від дорослих курей – нирки і яйцеводи.

Зараження курячих ембріонів. Використовують 8 – 10-

денні

ембріони. Деколи

при

виділенні

польових

ізолятів

вірусу

приходиться

проводити

не

менше6 –

8

“сліпих”

пасажів до тих пір, поки не почнуть проявлятися типові для

ІБП

патологічні

:зміникарликовість

ембріонів

з

перекручуванням шиї і прилипанням лапок

до

.голови

Звернуті

в

клубок

інфіковані

ембріони

круглої

, форми

щільної консистенції, кількість амніотичної рідини у таких

ембріонів

зменшена, оболонка

потовщена,

має

фібринозні

нашарування.

Ознаками ураження курячих ембріонів вірусом ІБП

вважають загибель їх на2 – 8-й день (летальність залежить

від вірулентності польового штаму) і характерні патологічні

зміни.

Вірус швидше адаптується при інокуляції матеріалу в

амніотичну порожнину чи на ХАО.

Для

підтвердження

наявності

вірусу

екстраембріональній

рідині

заражених

курячих

ембріонів

можна

поставити

РГА, попередньо

піддавши

матеріал

обробці трипсином.

Біопроба на курчатах. Використовують курчат 10 – 25-

денного

віку, що

завезені із господарств вільних від

респіраторних захворювань та ІБП.

Зараження культури клітин. Цей метод при первинній

ізоляції

вірусу

не

знаходить

практичного

використання.

Тільки

після 6

-–10

пасажів

на

курячих

ембріонах

ізольований

вірус

набуває

здатності

розмножуватись

і

викликати ЦПД в культурах клітин нирки, легенів і печінки

15 –18- денних курячих ембріонів.

Ідентифікація вірусу. Ідентифікацію вірусу проводять

за допомогою РН, РДП, РЗГА, РЗК, РІФ, РНГА та інших. РН

і РЗГА типоспецифічні використовуються для визначення

серологічного типу вірусу. РДП і РНГА ідентифікують вірус

без виявлення його типової приналежності.

ІМУНІТЕТ

І

ЗАСОБИ

СПЕЦИФІЧН

ПРОФІЛАКТИКИ.

Перехворівша

птиця

резистентна

до

зараження гомологічним штамом вірусом протягом 6 місяців.

Основним	методом	боротьби	з	ІБП	є	специфічна
профілактика	з використанням		живих	та	інактивованих

вакцин. Для виготовлення живих вакцин використовують селекцію польових з послабленою вірулентністю штамів, їх аттенуацію та клонування.

ТРАНСМІСИВНИЙ ГАСТРОЕНТЕРИТ СВИНЕЙ.

Інфекційний гастроентерит свиней(трансмісивний гастроентерит свиней, хвороба Дойла і Хетчінгса) - гостра висококонтагіозна хвороба, головним чином, поросят 2- тижневого віку, що проявляється рвотою, діареєю (сіро – зелені водянисті фекалії) і дегідратацією. Інфекційний гастроентерит свиней (ІГС) вперше діагностували і описали американські дослідники Хітчінгс і Дойл в 1946 році.

Вірус			ТГС		вперше		був	виділений		японським
дослідником Тайїма в 1970 році.
КУЛЬТИВУВАННЯ. Вірус вдається культивувати в
первинно		– трипсинізованих				культурах		клітин	тестикул,
шкіри,	легенів,		щитовидної залози				і в	перещеплювальній
культурі тестикул поросяти, не викликаючи									в	перших
пасажах ЦПД. ЦПД з’являється лише після попередньої
адаптації		вірусу.		Адаптований		до	культури		клітин, він
швидко розмножується та руйнує їх протягом2 – 4 днів в
залежності від дози. Для виділення вірусу найбільш придатні
культура			клітин		щитовидної			залози		свиней
перещеплювальна					лінія	РК–	15.	ЦПД		вірусу
характеризується в культурі клітин розвитком синцитію вже
через	24	години		після інокуляції. В			заражених		культурах
можна знайти величезні клітини в яких знаходиться 40до
ядер.	Майже		всі		ізоляти	вірусу		ТГС	в	первинно-

трипсинізованій культурі клітин щитовидної залози свині індукують утворення бляшок, розміри яких коливаються від 1 до 5 мм в діаметрі. Вірус, що пройшов численні пасажі в культурі клітин, здебільшого піддаються аттенуації але поряд з цим втрачають імуногенну активність.

Вірус ІГС як правило не розмножується в курячих ембріонах.

ГЕМАГЛЮТИНУЮЧІ ВЛАСТИВОСТІ. Вірус аглютинує еритроцити великої рогатої худоби, морських свинок і курчат.

СТІЙКІСТЬ ВІРУСУ. Вірус чутливий до ефіру, хлороформу і дезоксихолату натрію, стійкий до дії трипсину. Збудник ІГС стійкий при низьких температурах і навпаки висока температура досить швидко інактивує вірус. Стійкий до рН в межах від 4 до 10.

ПАТОГЕННІСТЬ. Вірус вражає поросят 3до – тижневого віку. Старші за віком поросята перехворюють в більш легкій формі та без летальних випадків. Захворювання

у	поросят	проявляється втратою апетиту, рвотою, діареєю
(білуваті,		жовтуваті	або	зеленуваті	пінисті	),фекалії
зневодненням, слабкістю і високою смертністю. У хворих
свиноматок різко знижується лактація. Інкубаційний період,
в	залежності від віку		поросят, триває від 12 до 36 годин. З

віком тварин інкубаційний період збільшується, а смертність зменшується. Захворювання розпочинається зниженням апетиту, пригніченням, сонливістю. У хворих поросят відмічають підвищену спрагу, рвоту, а температура тіла 41 – 41,50С. Клінічний період захворювання характеризується сильною діареєю з виділенням газів. Фекальні маси сірувато

– червоного або жовтувато– зеленуватого кольору. Стадія

видужування як		правило досить тривала. Хворі поросята
п’ють	багато	води	і	смокчуть,	якемолоков
неперетравленому вигляді виводиться з рідкими фекаліями.
Втрата	рідини	призводить	до	сильного		зневоднення
організму, внаслідок чого розвивається метаболічний ацидоз
та інші	зміни	в електролітичному балансі			. кровіХворі

поросята впадають в кому і здебільшого на третій день від початку захворювання гинуть. У виживших поросят через 3 – 4 дні розпочинається регенерація ворсинок і припиняється

діарея. Смертність поросят знижується по мірі збільшення віку. Віковий фактор також впливає на тривалість і тяжкість захворювання. У свиноматок, що заразилися при контакті з хворими поросятами, підвищується температура тіла, зникає апетит, відмічається депресія, незначна діарея і припиняється лактація. Поросята, що перехворіли ІГС, відстають в рості та розвитку.

При розтині трупів поросят знаходять, що кишечник розширений і заповнений рідиною з газами, стінки тонкого відділу кишечнику мають вигляд пергаментного паперу, а в просвіті його знаходиться неперетравлене молоко, шлунок переповнений.

ІГС

головним

чином

протікає

в

асоціації

з

бактеріальними

інфекціями

і

частіше

за

все

колібактеріозом. Смертність серед поросят 2 – 3 – тижневого

віку може досягати 100%.

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА. Діагноз на ІГС

ставлять на основі епізоотологічних даних, клінічних ознак

захворювання, патологоанатомічних

змін

і

лабораторних

досліджень.

Лабораторна

діагностика

включає

в

себе

виділення вірусу, ідентифікацію його в РН і РІФ в культурі

клітин та знаходження специфічних антитіл в сироватці крові

хворих і перехворівших тварин.

Виділення

вірусу.

Для дослідження

в

лабораторію

направляють

тонкий

відділ

кишечнику

з

її

,

вмістом

мезентеріальні лімфатичні вузли від поросят в початковій

стадії проявлення клінічних ознак захворювання. Крім того,

відбирають шматочки легенів, печінки, селезінки, нирок та

головного мозку

Зараження

культури

клітин. Виділення

вірусу

в

лабораторії

проводять

на

первинно– трипсинізованих

і

перещеплювальних

лініях

клітин

поросят(нирок,

щитовидної і слинних залоз, тестикул

Зараження сприятливих тварин. В зв’язку з наявністю

великої кількості штамів вірусу ІГС, що не проявляють в

культурі клітин ЦПД, біопроба на чутливих поросятах–

надійний метод виділення вірусу. Її зазвичай ставлять на

чутливих

поросятах 2 –

3-

денного

віку, що

отримані

із

господарств

вільних

від

цієї

інфекції. За

зараженими

поросятами ведуть спостереження протягом 3 – 4 днів. Поява

у заражених тварин рвоти і діареї протягом24 – 72 годин

після інокуляції свідчить, що в досліджуваному матеріалі є

вірус ІГС. На третій чи п’ятий день після початку діареї

тварини гинуть.

При розтині трупів поросят знаходять катаральний

ентерит,

а

при

гістологічному

дослідженні–

атрофію

ворсинок кишечнику.

Індикація та ідентифікація вірусу. Електронна (ЕМ) та

імуноелектронна мікроскопія (ІЕМ). Збудника захворювання

визначають по характерній ультраструктурі, що виявляють за

допомогою негативного контрастування.

РІФ. Цей метод використовують як експрес – метод для

індикації

та

ідентифікації

антигену вірусу ІГС

в

клітинах