Фізико-хімічні властивості днк

Варіабельність вмісту ГЦ-пар. Хоча співвідношення Г/Ц та А/Т у кожному виді організмів є сталим, вміст ГЦ-пар може значно варіювати у різних груп організмів, як показано на слайді 30. Як бачимо, даний параметр у відсотковому вираженні коливається від 22 до 73%, що значно позначається на фізичних властивостях ДНК.

Денатурація (плавлення) та поглинання світла молекулами ДНК. У випадку нагрівання молекул ДНК, нековалентні сили, що тримають обидва ланцюги разом послаблюються і розриваються. При цьому відбувається розходження ланцюгів – так звана денатурація або плавлення ДНК.

Температура, за якої розходиться рівно половина довжини ланцюга, називається температурою або точкою плавлення і позначається Т_П. На слайді 31 показаний типовий графік (крива) плавлення ДНК, отриманої з пневмококів. Ступінь розходження ланцюгів (денатурації, плавлення) визначається за збільшенням поглинання розчину ДНК за основної довжини хвилі у 260 нм.

НК поглинають світло цієї довжини хвилі через електронну структуру гетероциклів основ, які мають нерівномірно-розподілену електронну щільність у площинах основ, тому характеризуються енергопоглинаючими властивостями.

Коли ланцюги розташовані у вигляді хеліксу, пари основ екрануються всередині молекули, що призводить до зменшення поглинання світла основами. Коли відбувається розділення двох ланцюгів, поглинання за 260 нм зростає на 30-40%, що може слугувати індикатором інтактності ДНК під час плавлення та має назву гіперхромного ефекту (слайд 32а).

З кривої видно, що ступінь розходження ланцюгів ДНК під час нагрівання є відносно невеликою до тих пір, поки не буде досягнуто точки плавлення. Після цього розходження ланцюгів йде набагато швидше. Вміст ГЦ-пар в ДНК має значний ефект не значення Т_П, що видно зі слайду 32. Насправді, чим вищим є вміст ГЦ-пар, тим вищим є значення температури плавлення. Це відбувається тому, що три водневі зв’язки між Г та Ц розірвати важче, ніж два між А та Т. Тому ГЦ-збагачена ДНК є більш стійкою до нагрівання, ніж та, яка багата на АТ- пари.

Нагрівання не є єдиним шляхом денатурації ДНК. До факторів,що здатні роз’єднати два ланцюги ДНК, відносять також:

1. Органічні розчинники, такі як ДМСО або формамід,

2. Високий рівень рН,

3. Зниження концентрації солей.

Дані фактори здатні також знизити значення температури плавлення.

Вміст ГЦ-пар також впливає і на в’язкість розчинів ДНК. На слайді 33 показана лінійна залежність між кількістю ГЦ-пар та в’язкістю, що була виміряна центрифугуванням у градієнті хлористого цезію. Поясненням такого ефекту може слугувати більша молекулярна вага пари АТ у порівнянні з ГЦ.

Ренатурація ДНК. За певних умов розділені денатурацією ланцюги ДНК можуть знову поєднатися. Таке поєднання зветься віджигом або ренатурацією. Найбільш важливими трьома факторами вдалої ренатурації є наступні:

1. Температура. Найкращою вважається температура десь на 25⁰ С нижче точки Т_П. Така температура не здатна викликати денатурацію, але є достатньо високою, щоб спровокувати швидку дифузію ДНК-молекул та послаблення тимчасових зв’язків між парами основ, які не є комплементарними. Це дозволяє припустити, що швидке охолодження одразу після денатурації здатне припинити ренатурацію. Дійсно, така процедура має місце у біохімічній практиці, коли гарячі проби з денатурованою ДНК одразу ж занурюють у лід, така методика називається гасінням ДНК.

2. Концентрація ДНК. Вона також є важливою. У певних межах, чим вищою є концентрація ДНК, тим з більшою швидкістю відбудеться ренатурація.

3. Час, відведений на ренатурацію Очевидно, чим більшим є цей час, тим більша частина молекул ДНК ренатурує.

Дослідники Бріттен та Конне ввели спеціальний термін – С₀t, щоб врахувати одразу другий та третій фактори з вищенаведених. С₀t являє собою відношення добутку концентрації ДНК (С₀) у молях нуклеотидів на літр, та часу (t) у секундах. За умови, що всі інші фактори будуть незмінними, саме цей параметр є основним у визначенні рівня ренатурації комплементарних ланцюгів ДНК, тому можна побудувати наступну залежність - так звану криву С₀t (слайд 34). Відмітимо, що кількість реасоційованої фракції зростає зверху вниз, отже падіння кривої репрезентує збільшення рівня реасоціації.

Поглянемо на най лівішу криву, вона репрезентує синтетичну полі-А/полі-У ДНК. Оскільки така ДНК має найбільший ступінь компліментарності і асоціація може відбутись, починаючи з будь-якого місця молекули (ефективна складність структури складає лише 1 основу), така ДНК реасоціює за найменшого значення С₀t. Ближче до середини розташована крива, що отримана з ДНК бактеріофага Т4. Така ДНК є складнішою, ніж полі-А/полі-У, вона майже не містить повторів, тому параметр С₀t для неї виявляється в 200000 разів вищим.

Нарешті, ДНК теляти, яка тут представляє майже 70% усього геному тварини, тому є дуже складною молекулою. Кожен гаплоїдний набір хромосом містить близько 2 * 10⁹ пар основ, тому значення С₀t буде в 10000 разів вище, ніж у бактеріофагової ДНК. Іншими словами, для того, щоб зрівнятися зі значенням для Т4, концентрація ДНК теляти повинна бути в 10000 разів вищою. Таким чином, ми бачимо лінійну залежність складності ДНК від значення С₀t_1/2, тобто С₀t, за якої рівно половина ДНК ренатурує. Загалом, чим більш складною є ДНК, тим вищим є значення С₀t_1/2.

Зрозуміло, переважна частина еукаріотичної ДНК геному є в основному неповторюваною. Близько 40% ДНК миші має повтори, які присутні у кількості від 100 до 1000000 копій на гаплоїдний геном. На іншому боці знаходиться так звана високоповторювана ДНК, яка складає приблизно 10% від загальної кількості ДНК галоїдного набору хромосом. Такі повтори зустрічаються приблизно 1 мільйон разів на геном. Крива С₀t такої ДНК показана у вигляді сателітної ДНК миші на слайді 34.

Ще однією фракцією ДНК миші є помірно повторювана. Вона складає приблизно 30% геному. Комбінація повторюваної та унікальної ДНК у тваринному геномі дає складну криву С₀t, що показана на слайді 35. За дуже низьких значень С₀t спочатку ренатурує високоповторювана, потім середньоповторювана, і, нарешті, унікальна ДНК. Еукаріотична ДНК, розташована в генах білків, є, як правило, унікальною, гени рибосомальної РНК – середньоповторювані, а центромери хромосом є високо повторюваними (слайд 35).

На таблиці слайду 36 представлені розміри гаплоїдних геномів декількох організмів та вірусів. Дані представлені у трьох формах: молекулярна маса, кількість пар основ, довжина геному.