Визначення вторинної структури рнк

Хімічна модифікація. Майже всі реагенти, представлені на слайді 11, використовуються для визначення структури РНК. В основному, дослідження йде навколо рРНК та тРНК, одначе всі типи РНК були піддані таким дослідженням.

Використання нуклеаз. Осново-специфічні нуклеази, які є більш активними у одно ланцюгових регіонах РНК, представлені на слайді 5, також використовуються для виявлення вторинної структури РНК та її конформації. Насправді, дуже стабільні вторинні структури РНК можуть затруднювати їх вивчення, тому введення нуклеаз у даний процес є достатньо виправданим. Ми розглянемо лише дві найбільш вживані нуклеази:

1. Нуклеаза S₁ найбільш широко використовується у визначенні вторинної структури РНК, здатна гідролізувати одноланцюгові регіони як РНК, так і ДНК, після гідролізу залишає 5’-фосфатні продукти. Виділяється, як правило, з плісньового гриба Aspergillus oryzae. Розщеплення НК даною нуклеазою може бути здійснене за 85⁰ С, причому дає більш щільні електрофоретичні драбинки через кращі результати електрофоретичної мобільності олігонуклеотидів, у порівнянні з тими, які мають фосфати на 3’-кінцях (ОН-гідроліз, який ми вже згадували). Гідроліз нуклеазою S₁ інгібується подвійно ланцюговими регіонами або зв’язками у третинній структурі РНК – наприклад, у молекулі тРНК^Phe розщепленню піддається лише антикодон. Загалом S₁ здатна розщепити шпильки, шпилькові петлі, внутрішні петлі, виступи та опуклості (більш, ніж на один нуклеотид), тому є дуже ефективною у визначенні механізмів згортання РНК-молекул.

2. РНКаза V₁, навпаки, специфічна до подвійно ланцюгових регіонів РНК. Це ендонуклеаза, яку отримують з отрути кобри, вона гідролізує фосфодиефіри у складі РНК у місці подвійних ланцюгів або близько розташованих декількох одноланцюгових регіонів. Продуктом її гідролізу є 5’-фосфати, але, на відміну від S₁, ця нуклеаза майже не діє на ДНК. Розщеплення не є сильно специфічним до послідовності, але в районі дуплексів варіює незначно. Кожен ланцюг дуплексу ріжеться з незалежною ефективністю - наприклад, у тРНК^Phe з Е.соlі 5’-кінець акцепторного стебла розщеплюється добре, а 3’-кінець – ні. РНКаза V₁ здатна розщеплювати стекінгові регіони внутрішніх петель або петель шпильок. Схоже, що для прояву гідролітичної активності, даному ферменту потрібна послідовність з чотирьох або шести дуплексних чи стекінгових нуклеотидів.

Таким чином, комбінація хімічних та ензиматичних методів перетворюється на потужний інструмент визначення вторинної та третинної структури РНК. Перевагами такого методу є те, що:

1. Потрібні зовсім невеликі кількості матеріалу для аналізу.

2. За різницею у розмірах фрагментів можна легко визначати місця стеричних перешкод.

3. Ферменти працюють за достатньо широкого діапазону температур та інших умов.

4. Хімічні реагенти мають навіть вищу толерантність до умов дослідів.

Одначе, потрібно пам’ятати і про недоліки даного методу:

1. Розмір молекули ферменту може лімітувати його доступ до сайту гідролізу, тому не завжди специфічність є повністю визначеною.

2. Оскільки до уваги береться кінетичний ефект реакції, а не рівноважний, перевагу при утворенні продукту буде мати та фракція, яка має високу реактивність, навіть, якщо вона представлена мінімальною концентрацією. До того ж, зв’язування фермента може впливати на рівновагу.