Тема 3. Вищі форми структури днк. Будова хроматину Методи конденсації днк in vitro

Всі вищі форми структури ДНК так чи інакше пов’язані з конденсацією її молекул. Хоча майже всі методи вивчення ДНК потребують її присутності у розчині у вигляді витягнутих ниток, у біологічних системах дані полімери присутні у вигляді значно компактизованих часток. Взагалі під компактизацією або конденсацією треба розуміти зменшення об’єму, який займає молекула ДНК у розчині у вигляді подовженої спіралізованої структури, що буває дуже корисним для запаковування великої кількості генів у складі хромосом, у обмежений простір ядра. Для вивчення механізмів та особливостей компактизації ДНК використовують різні моделі in vitro із застосуванням певних агентів, що сприяють або індукують конденсацію. Коротко розглянемо дані підходи.

Використання конденсуючих агентів. Всі види таких агентів здійснюють конденсацію декількома наступними шляхами: зменшуючи сили відштовхування між сегментами ДНК (наприклад, нейтралізацією зарядів на фосфатних групах за допомогою введення катіонів), або змінюючи ступінь взаємодій між ДНК та розчинником (наприклад, додаючи етанол, який є гіршим розчинником для ДНК, ніж вода, або вводячи у розчин ще один полімер, який є більш гігроскопічним). До того ж, полівалентні катіони здатні індукувати локальні зігнутості та скривлення структури ДНК, що також може сприяти конденсації.

Катіони. Серед мультивалентних катіонів найчастіше використовують:

1. Поліаміни спермін та спермідин з зарядами +4 та +3 відповідно,

2. Неорганічні катіони, такі як Co(NH₃)₆³⁺,

3. Катіонні поліпептиди, наприклад, полі лізин,

4. Основні білки, наприклад, пістони Н1 та Н5.

Двовалентні катіони за нормальних умов не здатні індукувати конденсацію ДНК у розчинах, одначе здатні на це за підвищеної температури, або у метанольних розчинах.

Спирти. Етанол у 80% концентрації найчастіше використовують у якості преципітуючого агента під час очищення ДНК, одначе він також здатен конденсувати ДНК за певних умов. Наприклад, за 15-20% концентрації етанолу та за умови додавання Co(NH₃)₆³⁺ відбувається конденсація. Метанол та ізопропанол поводять себе схоже.

Нейтральні та аніонні полімери. Серед нейтральних варто відмітити поліетиленгликоль, який за високої йонної сили розчину здатен конденсувати ДНК. Отримана сконденсована структура має назву ψ-ДНК (psi-Polimer-and-Salt-Induced). Така ДНК може бути отримана за допомогою аніонних полімерів, таких як поліаспартат, поліглутамат, аніонні пептиди з капсиду бактеріофагу Т4.

Катіонні ліпосоми. Коли ДНК конденсується з допомогою цих агентів, даний комплекс являє собою молекулу ДНК, вбудовану у ліпосому. Його можна ефективно використати для трансфекції еукаріотичних клітин з двох основних причин:

1. Сконденсована ДНК є захищеною від дії нуклеаз та через малий розмір може проходити у відносно невеликі отвори,

2. Ліпідна оболонка навколо ДНК збільшує проникність клітинних мембран по відношенню до такого комплексу.

Існує також дещо складніша система конденсації, яка включає у себе позитивно заряджені міцели та гнучкі негативні поліпептиди або однониткові РНК. У даному випадку ДНК є частково вбудована у кістяк міцели та сконденсована у компактні хоральні структури. Причому вся міцела набуває вигляд витягнутого циліндра, одначе можливий варіант сферичної будови кластерів, групи яких стабілізуються аніонними полімерами, причому такі сфери можуть розміщуватися на кінцях циліндра. Це запобігає можливій елонгації міцел ДНК.

Форми структури конденсованої ДНК. Розрізняють наступні:

1. Тороїди – утворюються за умови додавання поліамінів або неорганічних полі катіонів у дуже розведений розчин ДНК (менше 1мкг/мл) і являють собою утвори у вигляді замкнених «бубликів» (слайд 2c та d). Вони дуже нагадують агрегати ДНК, що виявляються після м’якого лізису капсиду фагів Т2 та Т7 (слайд 2а та b). За допомогою даного підходу були отримані тороїди ДНК Т7 та ДНК тимусу теляти з додаванням спермідину.

2. Циліндри – дуже часто виявляються разом з тороїдами, одначе за умови присутності великої кількості етанолу є предомінантними формами. Причому зі збільшенням концентрації етанолу циліндри товщають та коротшають.

3. Нитки та пластинки – виникають за умови збільшення концентрації спиртів у середовищі інкубації. Наприклад, преципітація коротких фрагментів ДНК сперми лосося етанолом дає гексагональні пластинки товщиною близько 150 А. За умови додання йонів амонійного кобальту та зниження діелектричної константи за допомогою етанолу до значення менше 65, ДНК переходить у сітку багатоланцюгових ниток, причому самі молекули змінюють В-форму на А-ДНК, яка у принципі краще агрегується у нитки.

4. Ψ-ДНК – цю форму ДНК ми вже розглядали, вона формується за умови високої концентрації солі та присутності нейтральних або кислих полімерів. Порушення регулярної структури ДНК у даному випадку викликається силами відштовхування між полімером та ДНК, одначе сіль частково їх нейтралізує.

5. Рідкі кристали (паракристалінні форми)– формуються за дуже високих концентрацій ДНК, оскільки у даному випадку паралельні пучки циліндрів можуть утворювати багатомолекулярні нитки шляхом агрегації за присутності агентів конденсації, найчастіше – спермідину. Якщо ДНК є короткою та лінійною (наприклад, нуклеосомальна) рідко-кристалінна фаза формується дуже швидко за умови зростання концентрації або зменшення температури, причому концентрація ДНК може варіювати від 160 до 290 мг/мл. Дані структури є особливо важливими для вивчення будови НК шляхом кристалографії через дифракцію Х-променів у нитках ДНК. Саме таким чином були отримані перші дифракційні картини ДНК у 1953 році.

Розміри конденсованих часток. Розміри агрегатів ДНК є пропорційними до молекулярної ваги молекул. Наприклад, високомолекулярні тороїди з бактеріофага, як правило, мають у основі лише одну молекулу ДНК, в той час як у частках, сформованих з менших молекул (ДНК тимусу теляти або плазмід pUC) може бути декілька молекул, одначе розмір залишається приблизно тим же.

Типовий тороїд ДНК маж внутрішній радіус біля 150-200 А та зовнішній – 350-500 А. Це відповідає приблизно 40000 пар основ В-ДНК. Циліндр має довжину близько 1800 А, а товщину – 300 А. Плазміда довжиною 2700 пар основ, як правило, встигає 5 разів обернутися навколо вісі молекули у складі тороїду.

Сили та механізми конденсації ДНК. Таким чином, конденсація ДНК in vitro, яка може досягати ступеню 10000, як показано для фага Т7, можлива за рахунок:

1. Утворення зшивок – було показано, що ДНК під дією кондесуючих агентів у розчині високої йонної сили має таке розташування ланцюгів, що відстань між найближчими з них майже точно дорівнює регіонам зі зшивками. До того ж, зшивки допомагають стабілізувати особливо компактні типи конденсації.

2. Можливості поступового, а не раптового розпаду гнучкого полімера, яким є ДНК у розчині з високою йонною силою. Даний феномен описується теоретично за постулатами полімерної теорії змішаної ентропії, за якою жорсткі полімерні структури розпадаються за несприятливих умов набагато швидше, ніж гнучкі. Таким чином, поступове порушення структури ДНК дає достатньо часу для конденсації молекул, не руйнуючи останніх.

3. Утворення зігнутостей – формування локальних зігнутих ділянок ДНК загалом сприяє конденсації молекул.

4. Йонні взаємодії – полягають у частковій нейтралізації зарядів ДНК катіонами, що зменшує сили відштовхування між сусідніми сегментами ДНК, причому для щільної конденсації нейтралізації повинно піддатися як мінімум 90% зарядів молекул. До того ж використання декількох типів йонів тамультивалентних катіонів призводить до взаємодії між ними та ДНК, що може полегшити формування локальних зігнутостей та сприяти конденсації.

5. Сили гідрування – за умови конденсації неминуче відбувається перерозподіл водних молекул, що пов’язані з ДНК та складають гідратну оболонку останньої. Це веде до перерозподілу водневих зв’язків та до появи так званої сили гідрування – параметра, який є загально відомим у сфері фізики біополімерів і застосовується не лише по відношенню до ДНК. Вважається, що поява даної сили індукується в основному за рахунок додаткової поляризації води прилеглими групами ДНК, що за певних умов може сприяти конденсації.

6. Зміни вторинної структури – пов’язане з тим, що Z-форма ДНК набагато легше конденсується, ніж інші варіанти ДНК. Тому припускається, що за певних умов визначені послідовності перед конденсацією змінюють свою конфігурацію саме на цю форму ДНК.